人脂肪源干細胞與纖維蛋白膠共混在裸鼠體內(nèi)外的初步研究.pdf

1、目的：掌握人脂肪源干細胞（adipose-derivedstemcells,ADSCs）的分離、培養(yǎng)方法，并探討其部分生物學(xué)特性。探討纖維蛋白膠對ADSCs增殖的影響。構(gòu)建一種新型可注射型生物支架材料，為臨床修復(fù)軟組織缺損奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法：1.取脂肪抽吸術(shù)的脂質(zhì)部分，用酶消化法分離獲得ADSCs。倒置顯微鏡下觀察ADSCs體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)改變。利用MTT法檢測原代細胞活性并繪制細胞生長曲線；第3代（P3）細胞分別加入含胰島素

2、、甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、吲哚美辛的條件培養(yǎng)基和含地塞米松、磷酸甘油、維生素C的條件培養(yǎng)基進行定向誘導(dǎo)分化成脂、成骨。油紅O染色、茜素紅染色定性，鏡下觀察ADSCs變化。2.體外培養(yǎng)人ADSCs，取P3細胞接種到96孔板，以不同濃度（纖維蛋白原與凝血酶比例：4∶1、2∶1、8∶3、5∶2）纖維蛋白膠浸潤提取液培養(yǎng)，用MTT法檢測ADSCs在不同濃度纖維蛋白膠上的增殖情況。3.體內(nèi)實驗分5組：A組：單純纖維蛋白膠組，選用低濃度（

3、纖凝比4:1）纖維蛋白膠；B組：單純純化后的脂肪顆粒組；C組：單純ADSCs組，細胞濃度為3×106/ml；D組：細胞-脂肪復(fù)合物，細胞濃度為3×106/ml與純化后的脂肪顆粒1:1混合；E組：細胞-支架復(fù)合物，細胞濃度為3×106/ml與纖維蛋白膠1:1混合。每組0.3ml分別注射至裸鼠背部皮下，5點/只，共10只。觀察各組植入后，裸鼠的生命體征及局部變化，8周后取出，分別進行體積、濕重測定、HE染色等分析。
　　結(jié)果：原代細胞

4、顯示3-4h開始貼壁，最初呈類圓形，2-4d逐漸延伸，呈典型成纖維細胞。5d左右進入對數(shù)生長期，2-3周單層細胞融合率可達90％左右，細胞排列緊密成旋渦狀。傳代后2-4h開始貼壁，增殖迅速，2-4d即可達80%。一般3-8代細胞增殖活躍，之后稍減弱。P3細胞分化成脂、成骨，油紅O染色鏡下可見細胞中間有脂滴，茜素紅染色可見橢圓形結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)。不同濃度纖維蛋白膠制備的浸潤提取液所培養(yǎng)的ADSCs生長曲線無明顯差異。本次實驗10只裸鼠，植入復(fù)合

5、物后生命體征平穩(wěn)，注射部位未見明顯炎癥反應(yīng)，B、D、E組均可見新生組織形成，A、C組未見組織。大體觀察，B組和D組可見明顯脂肪顆粒，E組可見新生組織，但略少于B、D組。HE染色B、D、E組均可見脂肪細胞，D組富含膠原蛋白及脂肪顆粒。體積：D組＞B組＞E組；濕重：D組＞B組＞E組。
　　結(jié)論：構(gòu)建了一種簡單有效的體外分離和培養(yǎng)ADSCs的方法，ADSCs生長旺盛、增殖快，具有多向分化潛能，可以作為組織工程理想的種子細胞。不同濃度纖維