脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞纖維蛋白膠復(fù)合物修復(fù)成年兔骨軟骨缺損的研究.pdf

1、第一部分兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外向軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)。 目的：探索成年兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)的方法，研究其增殖和體外向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力。 方法：自成年兔頸后取脂肪組織，采用Ⅰ型膠原酶消化分離法獲取細(xì)胞。用含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并進行傳代，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。MTT法測定第4、8代細(xì)胞的增殖能力。軟骨誘導(dǎo)劑在體外誘導(dǎo)第5代細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況

2、。并于誘導(dǎo)1周后，對細(xì)胞進行番紅O染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色，RT-PCR法測定細(xì)胞Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：原代細(xì)胞培養(yǎng)2～3天后開始貼壁生長，逐漸伸展為梭形或多角細(xì)胞，約7～9天后細(xì)胞幾乎完全融合，細(xì)胞呈旋渦狀排列。傳代后的細(xì)胞第二天就可全部伸展為梭形或多角形，第4～6天后可生長到幾乎完全融合。8代之內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。第4代細(xì)胞倍增時間為31.5±2.7h，第8代細(xì)胞為33.9±6.0h，之間無顯著性差異(p>

3、0.05)。誘導(dǎo)后第2～3天細(xì)胞開始逐漸發(fā)生聚集。聚集的高密度細(xì)胞團塊番紅O染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性，未發(fā)生聚集的細(xì)胞則呈弱陽性或陰性。RT-PCR測定顯示誘導(dǎo)1周后的細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原mRNA，未誘導(dǎo)的細(xì)胞不表達(dá)Ⅱ型膠原mRNA。 結(jié)論：從成年兔脂肪組織中分離培養(yǎng)出的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，具有很強的增殖和自我更新能力，并具有向軟骨細(xì)胞分化的潛能。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的選擇之一。 第二部分纖維

4、蛋白膠與兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性的研究。 目的：研究纖維蛋白膠與兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生物相容性，探討其作為組織工程支架承載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性。 方法：將第4代兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞以5×10<'3>/孔，接種于96孔板中的纖維蛋白膠中(A組)、纖維蛋白膠表面(B組)和培養(yǎng)板表面(C組)。通過MTT法繪制備組細(xì)胞的生長曲線，并計算細(xì)胞倍增時間。倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞在培養(yǎng)板表面，纖維蛋白膠表面和內(nèi)部的形態(tài)及生長

5、情況。 結(jié)果：在纖維蛋白膠表面和96孔板表面生長的細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，B組和C組的細(xì)胞接種后經(jīng)過3天左右的滯留期，進入對數(shù)生長期，第7～8天逐漸發(fā)生融合，B組和C組的細(xì)胞倍增時間分別為33.3±6.1h和31.5±2.7h，兩組之間沒有顯著性差異(p=0.419>0.05)。在纖維蛋白膠內(nèi)部立體生長的細(xì)胞伸展及增殖速度緩慢，細(xì)胞形態(tài)以星形和類球形為主，A組細(xì)胞接種后經(jīng)過約8～9天的慢速生長期，才進入快速增長期，到第13～14天后

6、再次進入慢速生長期，A組的細(xì)胞倍增時間為39.7±10.6h，與C組之間有顯著性差異(p=0.03<0.05)。 結(jié)論：纖維蛋白膠與兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞之間具有良好的生物相容性。當(dāng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在纖維蛋白膠中立體生長時增殖速度緩慢。 第三部分脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞纖維蛋白膠復(fù)合物修復(fù)骨骼成熟兔骨軟骨缺損。 目的：探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞纖維蛋白膠復(fù)合物在骨骼成熟兔體內(nèi)環(huán)境下誘導(dǎo)成軟骨，修復(fù)骨軟骨損傷的可行性。 方法

7、：在32只骨骼發(fā)育成熟的中國白兔膝關(guān)節(jié)股骨滑車中央制作直徑為4mm，深約為4～5mm的骨軟骨缺損。在骨軟骨缺損中分別植入脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞纖維蛋白膠復(fù)合物(脂肪間充質(zhì)于細(xì)胞纖維蛋白膠復(fù)合物修復(fù)組)、無細(xì)胞的纖維蛋白膠(單純纖維蛋白膠修復(fù)組)或不做處理(自發(fā)修復(fù)組)。術(shù)后6周和12周分批處死實驗動物，觀察骨軟骨缺損修復(fù)的情況。 結(jié)果：術(shù)后6周，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞纖維蛋白膠復(fù)合物修復(fù)組以透明軟骨樣組織修復(fù)缺損，大體評分9.6±0.8分，

8、組織學(xué)評分1.4±0.5分；單純纖維蛋白膠修復(fù)組缺損區(qū)仍為缺損，大體評分4.7±0.5分，組織學(xué)評分14.0±0.0分；白發(fā)修復(fù)組主要由纖維組織修復(fù)，大體評分7.4±1.3分，組織學(xué)評分8.4±2.0分。術(shù)后12周，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞纖維蛋白膠復(fù)合物修復(fù)組以透明軟骨樣組織修復(fù)缺損，透明軟骨樣組織較6周時成熟，大體評分9.7±0.5分，組織學(xué)評分0.7±0.8分；單純纖維蛋白膠修復(fù)組缺損區(qū)仍未得到良好填充，大體評分4.0±0.0分，組織學(xué)評