抗血小板人源噬菌體抗體庫的構(gòu)建和初步篩選.pdf

1、噬菌體抗體庫是把體外隨機(jī)組合的全套抗體基因呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面，通過抗原的親和力選擇和噬菌體擴(kuò)增獲得特異性抗體基因的技術(shù)。該技術(shù)已廣泛用于制備人源單克隆抗體及免疫學(xué)研究中。本研究旨在運(yùn)用噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建一個經(jīng)血小板自身免疫的抗體組合文庫，為下步篩選針對血小板特異性靶點(diǎn)如GPⅡb/Ⅲa等的人源抗體，進(jìn)行以GPⅡb/Ⅲa受體等作為靶點(diǎn)的治療性人源抗體的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)首先從三名慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜患者的外周血中分

2、離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過半巢式PCR擴(kuò)增抗體輕鏈κ鏈基因和重鏈Fd段基因。先將輕鏈基因克隆到pComb3中，電轉(zhuǎn)化TG1菌構(gòu)建成κ輕鏈文庫，經(jīng)30次電轉(zhuǎn)后將輕鏈庫混合，庫容量達(dá)到2.88×106cfu，輕鏈插入率為60％。隨后將重鏈Fd段基因克隆到κ輕鏈文庫中，經(jīng)20次電轉(zhuǎn)后將抗體庫混合，得到庫容約為2.3×106cfu的人源噬菌體Fab抗體庫，同時含有輕鏈κ鏈基因和重鏈Fd基因的噬菌體約占40％。經(jīng)輔助噬菌

3、體超感染的噬菌體抗體庫滴度為5×1012pfu/ml. 用人活化的血小板包被96孔板，對抗體庫進(jìn)行3輪“吸附—洗脫—擴(kuò)增”的親和選擇，特異性噬菌體抗體得到有效的富集。經(jīng)ELISA鑒定，獲得幾株ELISA活性較高的能與人血小板結(jié)合的克隆。測序結(jié)果經(jīng)分析后顯示抗體輕鏈和重鏈Fd段在核苷酸和氨基酸水平都符合人免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)特征。 以上結(jié)果表明本研究利用慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜病人來源的抗體基因所構(gòu)建的人源性抗血小板噬菌體