新型抗ige人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)與功能研究

1、新型抗新型抗IgEIgE人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)與功能研究人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)與功能研究錢衛(wèi)珠【摘要】：【摘要】：研究目的:I型超敏反應(yīng)又稱過敏反應(yīng)主要由特異性IgE抗體所介導(dǎo)由于IgE處于變態(tài)反應(yīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最上游在變態(tài)反應(yīng)啟動(dòng)和發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。1987年首次提出應(yīng)用抗IgE抗體治療IgE介導(dǎo)的過敏性疾病并描述了具有特異性結(jié)合能力的抗IgE單克隆抗體。1993年Kolbinger等報(bào)道了一株鼠源性單抗(MaE11)的人源化

2、過程該抗體又稱為Omalizumab或Xolair包括大約5%的鼠源和95%的人源序列。2003年6月美國FDA批準(zhǔn)Xolair上市。上市伊始2004年在美國的銷售額即達(dá)到1.4億美元顯示出良好的市場前景。然而Xolair抗體與IgE的親和常數(shù)則僅有26nM左右當(dāng)抗IgE抗體的治療濃度達(dá)到IgE基礎(chǔ)水平的100倍時(shí)才可結(jié)合99%的IgE分子從而充分抑制IgE分子與FcεR相結(jié)合。在過敏性哮喘患者體內(nèi)游離IgE水平可升高數(shù)倍Xolair抗

3、體的臨床用量需要根據(jù)IgE的基礎(chǔ)水平進(jìn)行調(diào)整往往需要數(shù)百毫克才能達(dá)到治療效果。因此Xolair的治療費(fèi)用十分昂貴即使在美國也受到醫(yī)療保險(xiǎn)的限制目前僅用于吸入激素?zé)o法控制的嚴(yán)重病例。國外也有其它醫(yī)藥公司研制了抗IgE的人源化抗體(瑞士Novartis、美國Tanox公司)但由于其臨床療效尚不及Xolair均于1996年終止了臨床試驗(yàn)。本研究利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)制備了含有關(guān)鍵的功能表位的IgE片段(Fcε24)通過雜交瘤技術(shù)制備新型的高親和

4、力抗IgE單克隆抗體篩選具有競爭抑制IgE與其受體FcεR結(jié)合功能的克隆。為降低鼠源單抗的免疫原性對(duì)篩選獲得的抗體進(jìn)行人源化改造比較制備所獲抗體及Xolair與IgE結(jié)合的親和力及體外功能以期從結(jié)構(gòu)上闡明該抗體的作用機(jī)制。通過該課題的研究以期獲得親和力更高的、可望用于過敏性疾病預(yù)防和治療的新型抗IgE人源化單克隆抗體。研究方法:本課題采用小鼠雜交瘤技術(shù)利用IgEFcε24作為免疫原免疫獲得具有競爭抑制IgE與FcεR結(jié)合功能的鼠源單克隆

5、抗體。為進(jìn)一步降低單抗的免疫原性減輕用于人體時(shí)的HAMA反應(yīng)提高安全性我們采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)模擬抗體空間構(gòu)象的方法對(duì)鼠源抗體進(jìn)行了人源化改造對(duì)改造成功的人源化單克隆抗體體外功能進(jìn)行了詳細(xì)分析并與Omalizumab的體外功能進(jìn)行比較。我們應(yīng)用噬菌體隨機(jī)七肽庫對(duì)人源化單克隆抗體的抗原表位進(jìn)行親和淘選從而明確抗體識(shí)別的表位通過分析IgE與其高親和力受體FcεRIα的復(fù)合物結(jié)晶與抗IgE抗體所識(shí)別表位進(jìn)行比較從空間結(jié)構(gòu)上解釋和闡明抗IgE人源

6、化單克隆抗體的功能學(xué)基礎(chǔ)。結(jié)果:獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的IgEFcε24以及FcεRIA通過雜交瘤技術(shù)篩選獲得具有競爭抑制IgE與FcεR結(jié)合的鼠源抗IgE單克隆抗體7A5。利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的手段改造獲得親和力和特異性均較好的人源化抗IgE體Hu7A5m18。體外功能分析結(jié)果表明:Hu7A5m18可抑制IgE與可溶性及細(xì)胞表面FcεRI結(jié)合而對(duì)結(jié)合于細(xì)胞表面FcεRI的IgE則無影響Hu7A5m18可以抑制IgE與細(xì)胞表面FcεRI結(jié)合

7、導(dǎo)致的脫顆粒反應(yīng)。Hu7A5m18介導(dǎo)上述體外功能的EC50僅為Omalizumab的110左右。SPR技術(shù)檢測M7A5、Hu7A5m18及Omalizumab與IgE的親和力分別為1.9nM、1.7nM和23.8nM因此Hu7A5m18人源化改造成功而且該單抗的親和力明顯高于Omalizumab。我們應(yīng)用噬菌體隨機(jī)七肽庫對(duì)Hu7A5m18的抗原表位進(jìn)行親和淘選通過對(duì)陽性噬菌體序列的分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)非常保守的序列被高度擴(kuò)增而這個(gè)序列與I

8、gE恒定區(qū)Cε3片段內(nèi)的391KQR393高度同源。通過分一、材料5152（一）重組蛋白、抗體及細(xì)胞系51（二）試劑5152（三）主要儀器設(shè)備52二、方法5257（一）Hu7A5m18抑制IgE與可溶性FcεRI的結(jié)合實(shí)驗(yàn)5254（二）Hu7A5m18抑制IgE與細(xì)胞表面FcεRI的結(jié)合實(shí)驗(yàn)5455（三）Hu7A5m18與結(jié)合于細(xì)胞表面FcεRI的IgE的結(jié)合實(shí)驗(yàn)5556（四）Hu7A5m18抑制IgE引起脫顆粒的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)5657三、

9、結(jié)果5768（一）Hu7A5m18抑制IgE與可溶性FcεRI結(jié)合5762（二）Hu7A5m18抑制IgE與細(xì)胞表面FcεRI結(jié)合6266（三）Hu7A5m18不與結(jié)合于細(xì)胞表面FcεRI的IgE的結(jié)合6667（四）Hu7A5m18抑制IgE導(dǎo)致的脫顆粒6768四、討論6870第三部分抗IgE人源化單抗Hu7A5m18的結(jié)構(gòu)研究7085一、材料7072（一）菌株、噬菌體隨機(jī)文庫及抗體70（二）試劑配制7072（三）實(shí)驗(yàn)設(shè)備、器材72二、

10、方法7276（一）噬菌體隨機(jī)肽庫篩選Hu7A5m18抗原表位7276（二）Hu7A5m18抗原表位的鑒定76三、結(jié)果7684（一）噬菌體隨機(jī)肽庫篩選Hu7A5m18抗原表位7680（二）Hu7A5m18抗原表位的鑒定8084四、討論8485參考文獻(xiàn)8589綜述89109參考文獻(xiàn)104109在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明109112致謝112專家共識(shí)：外用中成藥在濕疹皮炎治療中的應(yīng)用2012122114:59來源：愛愛醫(yī)我要評(píng)論(