腫瘤抑制蛋白Spred2與LC3結(jié)合促進自噬成熟誘導(dǎo)自噬依賴性細胞死亡.pdf

1、目的:
　　細胞自噬(Autophagy)廣泛發(fā)生于真核細胞中，是進化保守的自我保護、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的機制，是細胞死亡的一種重要方式。自噬發(fā)生時，通過內(nèi)凹的膜結(jié)構(gòu)不斷延伸，形成內(nèi)吞小體，內(nèi)吞小體包裹衰老的細胞器及待分解的物質(zhì)形成自噬小體，自噬小體不斷成熟到達溶酶體，與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，在酸性溶酶體酶的作用下，降解自噬溶酶體內(nèi)包裹的物質(zhì)，使其分解代謝并循環(huán)利用，實現(xiàn)細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和細胞器的更新。在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的一系列自

2、噬相關(guān)基因(Autophagy associated gene，ATG)可以調(diào)控細胞自噬，目前已發(fā)現(xiàn)三十多個ATG基因參與自噬過程。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β(Microtubules associatedprotein1 light chain3-β，LC3)是哺乳動物中與酵母ATG8同源的基因，自噬發(fā)生時，LC3轉(zhuǎn)變?yōu)橹蚅C3Ⅱ，蛋白水平檢測LC3Ⅱ的增多和LC3Ⅱ在自噬體的膜定位，可作為自噬發(fā)生的標(biāo)志。自噬晚期，自噬小體成熟形成自

3、噬溶酶體，降解胞內(nèi)物質(zhì)，自噬底物蛋白p62(SQSTM1)的降解，可以用來檢測自噬流的發(fā)生。細胞自噬的過程主要受mTOR(mammalian target of rapamycin)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3Ks)信號通路的調(diào)控。通過抑制mTOR和Ⅰ型PI3K通路可以活化細胞自噬，而Ⅲ型PI3K信號通路與Ⅰ型PI3K信號通路作用相反，活化Ⅲ型PI3K可以促進自噬的發(fā)生。同時AM

4、PK、p53、Bcl2等信號分子也參與細胞自噬的調(diào)控。
　　細胞自噬是生物體最基本的生物學(xué)現(xiàn)象，影響生物體生長發(fā)育等多個過程。細胞自噬的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。根據(jù)腫瘤類型、發(fā)展階段的不同以及腫瘤細胞生長環(huán)境的不同，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起不同的作用，既可以促進腫瘤細胞的生長，也可以通過自噬抑制腫瘤的惡性擴增?；谧允稍谀[瘤中作用的兩面性，可以把自噬作為腫瘤治療的一個新的靶點。
　　Spred（Sprouty-rela

5、ted proteins with an EVH1 domain）蛋白家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與Sprouty相關(guān)的膜蛋白。哺乳動物中包括Spred1、Spred2、Spred3三個家族成員。Spred蛋白通常含有3個結(jié)構(gòu)域:EVH1(N-terminal Enabled/VASPhomology1 domain), KBD(central c-Kit binding domain)和SPR(C-terminalSprouty-relat

6、ed domain)。研究表明Spred蛋白家族負調(diào)控ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細胞的生長發(fā)育、增殖，血管淋巴管的生成，骨骼的形成和組織的運動能力等，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、遷移侵襲有著密切的聯(lián)系。Spred2是一個腫瘤抑制蛋白，抑制腫瘤細胞的增殖與分化。在一些腫瘤組織中，Spred1、Spred2均較正常組織表達量低，并且Spred的表達下降可能是腫瘤形成與惡化的重要標(biāo)志。對Spred2的研究可能為腫瘤治療提供新的治療策略與靶點，

7、但目前Spred2抑制細胞增殖的機制尚不明確。
　　本研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中，過表達Spred2促進自噬體的形成，加快自噬溶酶體的成熟，進而引起腫瘤細胞發(fā)生自噬依賴性細胞死亡。本研究證實，在人宮頸癌HeLa細胞中，穩(wěn)定敲低Spred2后，可以顯著的抑制自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）誘導(dǎo)的自噬體成熟，重新過表達Spred2，可以回復(fù)該效應(yīng)。我們進一步對Spred2引起腫瘤細胞自噬的分子機制進行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，Sp

8、red2通過其SPR結(jié)構(gòu)域中的與LC3結(jié)合的基序LIR(LC3-interacting region)序列與LC3蛋白相互作用和細胞內(nèi)共定位。LIR基序突變體顯著減弱了Spred2調(diào)節(jié)的自噬體的成熟。此外，Spred2通過其SPR結(jié)構(gòu)域與p62蛋白存在相互作用和細胞內(nèi)的共定位。在人宮頸癌細胞HeLa細胞中，Spred2與p62和溶酶體的標(biāo)志蛋白LAMP2存在三者的細胞內(nèi)共定位，提示p62參與Spred2調(diào)節(jié)的促進自噬體的成熟。在證實了S

9、pred2蛋白的分子作用機制基礎(chǔ)上，我們進一步對Spred2蛋白引起的自噬是否與其介導(dǎo)的細胞死亡相關(guān)進行了研究。缺失Spred2的SPR結(jié)構(gòu)域，或者將其LIR基序突變后，減弱了Spred2引起的腫瘤細胞死亡，表明LIR基序為Spred2促進腫瘤細胞死亡所必需。此外，自噬抑制劑氯喹(Choroquine，CQ)顯著抑制了過表達Spred2引起的細胞死亡。而在人宮頸癌細胞HeLa和人肺癌細胞A549中，敲低自噬相關(guān)基因ATG5、LC3、p6

10、2，同樣抑制了過表達Spred2引起的促進腫瘤死亡的效應(yīng)。基于上述研究我們推斷細胞自噬可能是Spred2蛋白促進腫瘤細胞死亡抑制腫瘤細胞增殖的一個新的機制。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Spred2可以促進自噬體的成熟、自噬溶酶體的融合，引起腫瘤細胞自噬依賴性細胞死亡。
　　方法:
　　1.分子構(gòu)建Spred2蛋白LIR基序的突變體
　　2.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
　　3.腺病毒感染瞬時表達目的蛋白
　　4.免疫共沉淀和體外

11、GST-Pull-down檢測蛋白的相互作用
　　5.免疫熒光實驗檢測蛋白細胞內(nèi)共定位
　　6.細胞平板克隆形成、臺盼藍計數(shù)、流式細胞儀檢測細胞增殖及凋亡
　　結(jié)果:
　　1.過表達Spred2抑制腫瘤細胞的增殖
　　2.Spred2與LC3、p62存在相互作用和細胞內(nèi)定位
　　3.Spred2參與自噬過程，并促進自噬體的成熟
　　4.過表達Spred2引起腫瘤細胞自噬依賴性的細胞死亡