2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  細(xì)胞自噬(Autophagy)廣泛發(fā)生于真核細(xì)胞中,是進(jìn)化保守的自我保護(hù)、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的機(jī)制,是細(xì)胞死亡的一種重要方式。自噬發(fā)生時(shí),通過內(nèi)凹的膜結(jié)構(gòu)不斷延伸,形成內(nèi)吞小體,內(nèi)吞小體包裹衰老的細(xì)胞器及待分解的物質(zhì)形成自噬小體,自噬小體不斷成熟到達(dá)溶酶體,與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體,在酸性溶酶體酶的作用下,降解自噬溶酶體內(nèi)包裹的物質(zhì),使其分解代謝并循環(huán)利用,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新。在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的一系列自

2、噬相關(guān)基因(Autophagy associated gene,ATG)可以調(diào)控細(xì)胞自噬,目前已發(fā)現(xiàn)三十多個(gè)ATG基因參與自噬過程。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β(Microtubules associatedprotein1 light chain3-β,LC3)是哺乳動(dòng)物中與酵母ATG8同源的基因,自噬發(fā)生時(shí),LC3轉(zhuǎn)變?yōu)橹蚅C3Ⅱ,蛋白水平檢測(cè)LC3Ⅱ的增多和LC3Ⅱ在自噬體的膜定位,可作為自噬發(fā)生的標(biāo)志。自噬晚期,自噬小體成熟形成自

3、噬溶酶體,降解胞內(nèi)物質(zhì),自噬底物蛋白p62(SQSTM1)的降解,可以用來檢測(cè)自噬流的發(fā)生。細(xì)胞自噬的過程主要受mTOR(mammalian target of rapamycin)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3Ks)信號(hào)通路的調(diào)控。通過抑制mTOR和Ⅰ型PI3K通路可以活化細(xì)胞自噬,而Ⅲ型PI3K信號(hào)通路與Ⅰ型PI3K信號(hào)通路作用相反,活化Ⅲ型PI3K可以促進(jìn)自噬的發(fā)生。同時(shí)AM

4、PK、p53、Bcl2等信號(hào)分子也參與細(xì)胞自噬的調(diào)控。
  細(xì)胞自噬是生物體最基本的生物學(xué)現(xiàn)象,影響生物體生長(zhǎng)發(fā)育等多個(gè)過程。細(xì)胞自噬的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。根據(jù)腫瘤類型、發(fā)展階段的不同以及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的不同,自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起不同的作用,既可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),也可以通過自噬抑制腫瘤的惡性擴(kuò)增?;谧允稍谀[瘤中作用的兩面性,可以把自噬作為腫瘤治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。
  Spred(Sprouty-rela

5、ted proteins with an EVH1 domain)蛋白家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與Sprouty相關(guān)的膜蛋白。哺乳動(dòng)物中包括Spred1、Spred2、Spred3三個(gè)家族成員。Spred蛋白通常含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域:EVH1(N-terminal Enabled/VASPhomology1 domain), KBD(central c-Kit binding domain)和SPR(C-terminalSprouty-relat

6、ed domain)。研究表明Spred蛋白家族負(fù)調(diào)控ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、增殖,血管淋巴管的生成,骨骼的形成和組織的運(yùn)動(dòng)能力等,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、遷移侵襲有著密切的聯(lián)系。Spred2是一個(gè)腫瘤抑制蛋白,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與分化。在一些腫瘤組織中,Spred1、Spred2均較正常組織表達(dá)量低,并且Spred的表達(dá)下降可能是腫瘤形成與惡化的重要標(biāo)志。對(duì)Spred2的研究可能為腫瘤治療提供新的治療策略與靶點(diǎn),

7、但目前Spred2抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明確。
  本研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中,過表達(dá)Spred2促進(jìn)自噬體的形成,加快自噬溶酶體的成熟,進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬依賴性細(xì)胞死亡。本研究證實(shí),在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中,穩(wěn)定敲低Spred2后,可以顯著的抑制自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)誘導(dǎo)的自噬體成熟,重新過表達(dá)Spred2,可以回復(fù)該效應(yīng)。我們進(jìn)一步對(duì)Spred2引起腫瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn),Sp

8、red2通過其SPR結(jié)構(gòu)域中的與LC3結(jié)合的基序LIR(LC3-interacting region)序列與LC3蛋白相互作用和細(xì)胞內(nèi)共定位。LIR基序突變體顯著減弱了Spred2調(diào)節(jié)的自噬體的成熟。此外,Spred2通過其SPR結(jié)構(gòu)域與p62蛋白存在相互作用和細(xì)胞內(nèi)的共定位。在人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞中,Spred2與p62和溶酶體的標(biāo)志蛋白LAMP2存在三者的細(xì)胞內(nèi)共定位,提示p62參與Spred2調(diào)節(jié)的促進(jìn)自噬體的成熟。在證實(shí)了S

9、pred2蛋白的分子作用機(jī)制基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步對(duì)Spred2蛋白引起的自噬是否與其介導(dǎo)的細(xì)胞死亡相關(guān)進(jìn)行了研究。缺失Spred2的SPR結(jié)構(gòu)域,或者將其LIR基序突變后,減弱了Spred2引起的腫瘤細(xì)胞死亡,表明LIR基序?yàn)镾pred2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡所必需。此外,自噬抑制劑氯喹(Choroquine,CQ)顯著抑制了過表達(dá)Spred2引起的細(xì)胞死亡。而在人宮頸癌細(xì)胞HeLa和人肺癌細(xì)胞A549中,敲低自噬相關(guān)基因ATG5、LC3、p6

10、2,同樣抑制了過表達(dá)Spred2引起的促進(jìn)腫瘤死亡的效應(yīng)?;谏鲜鲅芯课覀兺茢嗉?xì)胞自噬可能是Spred2蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡抑制腫瘤細(xì)胞增殖的一個(gè)新的機(jī)制。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Spred2可以促進(jìn)自噬體的成熟、自噬溶酶體的融合,引起腫瘤細(xì)胞自噬依賴性細(xì)胞死亡。
  方法:
  1.分子構(gòu)建Spred2蛋白LIR基序的突變體
  2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
  3.腺病毒感染瞬時(shí)表達(dá)目的蛋白
  4.免疫共沉淀和體外

11、GST-Pull-down檢測(cè)蛋白的相互作用
  5.免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白細(xì)胞內(nèi)共定位
  6.細(xì)胞平板克隆形成、臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡
  結(jié)果:
  1.過表達(dá)Spred2抑制腫瘤細(xì)胞的增殖
  2.Spred2與LC3、p62存在相互作用和細(xì)胞內(nèi)定位
  3.Spred2參與自噬過程,并促進(jìn)自噬體的成熟
  4.過表達(dá)Spred2引起腫瘤細(xì)胞自噬依賴性的細(xì)胞死亡
 

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