陽離子脂質(zhì)體通過抑制晚期自噬流導(dǎo)致細(xì)胞死亡.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、陽離子脂質(zhì)體作為非病毒載體被大量應(yīng)用于基因治療,目前為止已經(jīng)有兩個相關(guān)臨床試驗已經(jīng)開展,分別是治療肺泡囊性纖維化和難治性白血病的研究,很不幸的是這些臨床試驗因為難以預(yù)料的相關(guān)致死性副作用而未能如期進(jìn)入二期臨床試驗或者在病人招募階段遇到困難。于是探索其毒性機(jī)制變得尤為關(guān)鍵。目前檢索到的關(guān)于陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性的文章有一篇15年1月份發(fā)表在cellreasearch的研究報道了陽離子脂質(zhì)體通過損壞Na+/K+-ATP酶泵的作用而導(dǎo)致細(xì)胞壞死

2、,但是作者依然認(rèn)為需要更多的研究去闡明陽離子脂質(zhì)體的生物學(xué)效應(yīng),繼續(xù)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)陽離子脂質(zhì)體對自噬流的影響發(fā)現(xiàn)有2個研究報道:Roberts R發(fā)現(xiàn)陽離子脂質(zhì)體引發(fā)自噬,Man N等發(fā)現(xiàn)陽離子脂質(zhì)體激活自噬是mTOR非依賴的。需要注意的是自噬流是一個動態(tài)過程,也就是說自噬流可能在一段時間區(qū)間內(nèi)激活阻斷交替出現(xiàn),預(yù)示著應(yīng)該多個時間點來評估自噬,所以,假設(shè)陽離子脂質(zhì)體可能是動態(tài)調(diào)控自噬的:也就是陽離子脂質(zhì)體早期激活自噬流然后晚期將其阻斷,陽

3、離子脂質(zhì)體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性是由于其抑制了自噬這一腫瘤細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。
  為了闡明陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性的潛在機(jī)制,細(xì)致研究了陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性,陽離子脂質(zhì)體對人肝臟表皮細(xì)胞系(因為大部分納米顆粒主要累計在肝臟)自噬流的影響。
  本文的研究內(nèi)容分為四個部分:(1)制備表征優(yōu)異的陽離子脂質(zhì)體,并可以導(dǎo)致細(xì)胞壞死。(2)揭示陽離子調(diào)控自噬流的過程是動態(tài)的。(3)探索陽離子脂質(zhì)體阻斷晚期自噬流的機(jī)制(4)說明細(xì)胞毒效應(yīng)至少和阻

4、斷自噬導(dǎo)致的損傷有關(guān)。
  第一部分,本實驗室納米脂質(zhì)體制備工藝成熟,采用薄膜分散法制備產(chǎn)生的納米脂質(zhì)體通過馬爾文動態(tài)掃描顯示脂質(zhì)體粒徑大小為166.13±6.2 nm且分布結(jié)果優(yōu)異,PDI系數(shù)0.11±0.05,陽性電荷為36.57±3.27 mv。通過TEM可以看到陽離子脂質(zhì)體為球形,雙層膜結(jié)構(gòu),大小大約100 nm左右。接著將陽離子脂質(zhì)體作用于細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性下降,且這種下降不是抑制細(xì)胞增殖而是導(dǎo)致細(xì)胞死亡引起的。

5、  第二部分,揭示陽離子調(diào)控自噬流的過程是動態(tài)的。前人的研究顯示陽離子脂質(zhì)體可以激活自噬,首先通過WB(western blot)試驗重復(fù)出來了這一結(jié)果,但是隨著時間的進(jìn)行,發(fā)現(xiàn)陽離子脂質(zhì)體最終是阻斷自噬的,這種調(diào)控是mTOR(mechanistic target of rapamycin)非依賴的。為了驗證這一發(fā)現(xiàn),使用LC3串聯(lián)RFP和GFP的雙熒光蛋白(RFP-GFP-LC3 Tandem mRFP/mCherry-GFP flu

6、orescence)來檢測自噬流,結(jié)果和WB一直,為了再次驗證陽離子最終阻斷自噬,通過加入自噬阻斷劑CQ(chloroquine)后通過WB和Cyto-ID(CYTO-ID Autophagy Detection Kit)來驗證,結(jié)果證實了陽離子脂質(zhì)體晚期的確是阻斷自噬流。
  第三部分,探索陽離子脂質(zhì)體阻斷晚期自噬流的機(jī)制。通過LC3-GFP和Lysotraker-red染色后共聚焦拍攝觀察到自噬流的融合受到了影響,然后通過電鏡

7、發(fā)現(xiàn)溶酶體變肥大,腫脹,同時線粒體嵴膜結(jié)構(gòu)消失,和大量自噬小體的產(chǎn)生,為了進(jìn)一步說明溶酶體發(fā)生了哪些變化,我們同過Acridine orange(AO)染色和LysoSensor Green DND-189染料發(fā)現(xiàn)溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境被堿性化,接著通過多功能酶標(biāo)儀發(fā)現(xiàn)溶酶體的酸性磷酸酶活性下降,說明其降解能力下降。
  第四部分,說明細(xì)胞毒效應(yīng)至少和阻斷自噬導(dǎo)致的損傷有關(guān)。已經(jīng)有研究報道了陽離子脂質(zhì)體可以導(dǎo)致溶酶體膜滲透性增加,導(dǎo)致蛋

8、白激酶cathepsinB釋放出來,然后損傷線粒體和導(dǎo)致活性氧上升,引起細(xì)胞死亡。為了驗證這一機(jī)制,接著通過MitoTracker green(MTR green)和CM-H2DCFDA green(ROS green)標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了陽離子脂質(zhì)體可以導(dǎo)致細(xì)胞的線粒體發(fā)生功能障礙和活性氧上調(diào),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,這種調(diào)控機(jī)制可以被SiRNA-ATG7基因干擾和自噬阻斷劑再現(xiàn),并且可以被活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸NAC部分逆轉(zhuǎn)。說明陽離子脂質(zhì)體

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