Sm22α基因敲除小鼠繁育方法的改進及在宮縮乏力研究中的應用.pdf

1、目的：平滑肌22α（smooth muscle22α，SM22α）是一種分子量22kDa的actin結合蛋白，用于血管平滑肌細胞分化及表型轉化的研究。Sm22α基因敲除（Sm22α-/-）小鼠在人類相關疾病的研究中已得到廣泛應用。然而，Sm22α-/-小鼠的傳統(tǒng)繁育方法產生的純合型子代數(shù)量較少，且易出現(xiàn)宮內窘迫，引起母、胎鼠死亡，無法滿足相關研究的需要。本文對Sm22α-/-小鼠的傳統(tǒng)繁育方法進行改進，提高子代小鼠的純合率，進而初步探討

2、宮內窘迫發(fā)生的機制。
　　方法：⑴采用純合子交配方式即雄性純合子與雌性純合子交配，并對有分娩征兆的孕鼠實施剖腹產手術，剖出的仔鼠由 ICR雌鼠代乳。同時用傳統(tǒng)的雜合子交配方式即雄性純合子與雌性雜合子交配作為對照，比較兩種繁育方式的雌鼠受孕率及產生仔鼠的斷乳后存活率。⑵利用化學消化法提取兩種交配方式產生的子代小鼠的基因組DNA，聚合酶連式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術擴增相應目的片段；PCR擴

3、增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外凝膠成像儀下分析小鼠基因型并計算兩種繁育方法產生子代的純合率。⑶解剖分離野生型（Sm22α+/+）雌鼠與 Sm22α-/-雌鼠的子宮，觀察比較其大體形態(tài)；通過組織冰凍切片HE染色，觀察子宮壁的形態(tài)結構，應用圖像分析軟件計算子宮中膜平滑肌肌層相對厚度（中膜肌層厚度與子宮壁厚度的比值），進而探討敲除Sm22α對子宮平滑肌發(fā)育的影響。⑷應用偶聯(lián)熒光基團的鬼筆環(huán)肽分別對野生型及Sm22α-/-小鼠的子宮平滑肌組

4、織中的F-actin進行冰凍切片熒光染色，熒光顯微鏡下觀察熒光強度，進而定量分析F-actin的含量。⑸為了在細胞水平探討SM22α在子宮平滑肌收縮中的作用，應用改良組織貼塊法培養(yǎng)野生型及Sm22α-/-小鼠子宮平滑肌細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長特點并用特異性平滑肌肌動蛋白（ smooth muscleα-actin，SMα-actin）的免疫熒光染色進行細胞鑒定。⑹為了進一步驗證 SM22α在 actin聚合中的作用，分別對野

5、生型及Sm22α-/-小鼠的子宮平滑肌細胞中應力纖維及SM22α進行熒光染色分析，觀察二者的共定位情況并分析敲除 Sm22α基因對子宮平滑肌細胞中應力纖維形成的影響。⑺所有數(shù)據均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：①純合子繁育方式與傳統(tǒng)雜合子繁育方式相比，雌鼠受孕率分別為50％和60%，仔鼠斷乳后

6、存活率分別為87.70%和88.60%，且兩種繁育方式相比均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；②純合子繁育方式與傳統(tǒng)雜合子繁育方式產生子代的純合子率分別為100%和47%，基本符合孟德爾遺傳定律；③與野生型相比，Sm22α-/-雌鼠子宮大體形態(tài)無明顯差異，但其中膜平滑肌肌層相對厚度較小，與野生型相比具有顯著差異（P<0.05）；④組織熒光染色結果顯示，Sm22α-/-小鼠與野生型小鼠相比子宮平滑肌纖維中細胞骨架蛋白F-actin的相對含量偏

7、低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這表明SM22α影響actin的聚合；⑤成功培養(yǎng)野生型與Sm22α-/-小鼠原代子宮平滑肌細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)為梭形并呈典型的“峰-谷”樣生長；特異性的SMα-actin免疫熒光染色顯示，單層細胞中陽性細胞率在95%以上；⑥子宮平滑肌細胞應力纖維熒光染色結果顯示，在野生型小鼠子宮平滑肌細胞中，應力纖維呈束狀，平行排列，SM22α與應力纖維共定位；而Sm22α-/-小鼠的子宮平滑肌細胞中，