eIF5A對細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、論文答辯日期： 2 0 1 3 年5 月1 1 日溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文摘要eIF 5 A 對細(xì)胞增殖的影響目的真核細(xì)胞翻譯起始因子5 A ( e u k a r y o t i c t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n f a c t o r5 A ，e I F 5 A ) 是一種真核生物細(xì)胞內(nèi)的小分子蛋白，在細(xì)胞生長、發(fā)育、衰老等多方面，尤其對是細(xì)胞增殖起著非常重要的作用，同時核糖體也能

2、夠被其刺激發(fā)揮功能，但是對e I F 5 A 在各種途徑中是如何發(fā)揮調(diào)控機(jī)制仍不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)在于構(gòu)建人e I F 5 A 基因的融合表達(dá)載體并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)p G E x 一4 T 一卜e I F 5 A融合蛋白后，將正確表達(dá)的融合蛋白轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來研究其對細(xì)胞增殖的影響。方法以p C M V 6 一X L 4 一e I F 5 A 作為模板，經(jīng)P C R 技術(shù)擴(kuò)增目的片段，將獲得的目的片段先連接到T 載體，再經(jīng)過

3、內(nèi)切酶( E c o R I 、X h oI ) 剪切后，將帶有酶切位點(diǎn)的目的片段，連接到預(yù)先用相同內(nèi)切酶處理后的原核表達(dá)載體p G E X 一4 T 一1 上，經(jīng)雙酶切鑒定、D N A 測序檢測插入序列的正確性。將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒p G E X 一4 T 一卜e l F 5 A 轉(zhuǎn)化到E ．c o l i B L 2 1 內(nèi)，在一定條件下經(jīng)過一定濃度I P T G 誘導(dǎo)后，收集足量菌體，通過超聲破壞菌體的方法提取細(xì)菌目的蛋白，測

4、濃度后經(jīng)過G S T 瓊脂糖珠p u l l —d o w n 純化，再使用S D S - P A G E 電泳分析以及w e s t e r nb l o t檢測人e l F 5 A 蛋白的表達(dá)。然后，在e l F 5 A 鑒定正確后通過蛋白轉(zhuǎn)染試劑E n t r a n s t e r T M —K 轉(zhuǎn)染至小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)，并通過M T T 分析檢測來研究e I F 5 A對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒p G E X

5、 - 4 T 一卜e l F 5 A 后，經(jīng)D N A 測序證實(shí)插入序列與設(shè)計(jì)完全一致，G S Tp u l l —d o w n 后電泳分析以及w e s t e r nb l o t 結(jié)果說明大腸桿菌B L 2 1 誘導(dǎo)后表達(dá)出人e l F S A 的g l u t a t h i o n eS —t r a n s f e r a s e ( G S T ) 融合蛋白。M T T 分析研究初步證明重組e l F 5 A 蛋白在細(xì)胞