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文檔簡介
1、腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率占全身惡性腫瘤的3%,透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)和乳頭狀腎細胞癌是最常見的RCC類型,在腎癌中的比例分別為60%~85%和7%~14%。RCC其起源于腎小管上皮細胞。局限性腎癌患者中約有30%會在術后出現(xiàn)局部復發(fā)或遠處轉移,是導致患者死亡的主要原因,而腎癌發(fā)生復發(fā)、轉移的機
2、制尚不清楚。癌易感性候選基因2(cancer susceptibility candidate2,CASC2)是屬于長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),定位于染色體的10q26,最初發(fā)現(xiàn)CASC2在子宮內(nèi)膜癌中表達下調(diào),起到抑癌基因的作用,外源性上調(diào)CASC2的表達可以顯著抑制未分化的子宮內(nèi)膜癌細胞生長,CASC2還可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的轉移,但是,CASC2在RCC中的表達情況及其功能尚不清楚。微小
3、RNA(microRNA,miRNA)也是非編碼RNA分子,其在細胞的增殖、轉移、侵襲、凋亡和細胞周期等生物進程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,有研究表明lncRNA是新的miRNA作用靶點,本研究檢測了CASC2在RCC組織、癌旁正常腎組織及腎癌細胞株中的表達水平,發(fā)現(xiàn)CASC2在RCC的表達明顯下降,起到抑癌基因作用;miRNA-21(miR-21)以順序特異性的方式下調(diào)CASC2的表達;通過miR-21調(diào)節(jié)CASC2表達可以部分消除CASC
4、2介導的腫瘤抑制作用。因此,CASC2可能是RCC新的預后標志物和有效的治療靶點。
第一部分 CASC2在腎細胞癌中的表達及意義
目的:
研究RCC癌組織及癌旁組織中CASC2的表達,不同RCC細胞株中CASC2的表達,探討CASC2在RCC的可能作用。
方法:
采用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(Real-time Quantitative PCR, qPCR)檢測32例癌組織和癌旁組織
5、中CASC2的表達水平。根據(jù)病理分期,患者預后,分析其相關性。檢測RCC細胞株786-O、A498和人胚胎腎細胞(HEK293)中CASC2基因表達情況,并對其進行比較和相關分析。
結果:
qPCR結果顯示:RCC組織與相應癌旁正常腎組織中的CASC2表達有差異,在RCC組織中CASC2的表達明顯均低于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學意義;分析了CASC2表達水平與病理分期的關系:發(fā)現(xiàn)CASC2低表達的比例在低分期組(pT1
6、+pT2)中較低,高分期組(pT3+pT4)較高,分別是44.8%(13/29)和66.7%(2/3);Kaplan-Meir生存曲線分析發(fā)現(xiàn)CASC2高表達組患者的預后明顯優(yōu)于CASC2低表達組,具有統(tǒng)計學意義。CASC2在RCC細胞株786-O、A498中的表達明顯低于HEK293細胞株,差異具有統(tǒng)計學意義。
結論:
RCC組織和RCC細胞株中CASC2的表達明顯降低,表明CASC在腎癌中起到抑癌基因的作用。隨著
7、腫瘤進展分期升高,CASC2低表達的比例越高,CASC2低表達組患者預后不佳,CASC2低表達可能是患者預后不佳的標志物。
第二部分 調(diào)控CASC2表達水平對腎細胞癌增殖和遷移的影響
目的:
通過檢測上調(diào)CASC2表達對RCC細胞增殖、遷移能力的影響,驗證CASC2在RCC中的作用。
方法:
構建高表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CASC2;通過高表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CASC
8、2轉染上調(diào)CASC2表達后,使用MTT法和細胞劃痕實驗,觀察786-O和A498細胞株的增殖、遷移是否受影響。
結果:
pcDNA3.1(+)-CASC2過表達質(zhì)粒轉染后,786-O和A498細胞的OD值分析表明細胞增殖明顯減少;同樣,過表達CASC2可以明顯抑制786-O和A498細胞的遷移能力。
結論:
上調(diào)CASC2的表達水平可以抑制RCC細胞的增殖和遷移,CASC2有腫瘤抑制作用。
9、 第三部分 miR-21可特異性結合CASC2并調(diào)控其功能
目的:
本研究通過生物信息學分析尋找CASC2的關聯(lián)miRNA,確認其與CASC2特異性結合能力和靶向調(diào)控作用。
方法:
根據(jù)miRanda(http://www.microrna.org)和miRcode(http://www.mircode.org)數(shù)據(jù)庫,通過計算機輔助得出CASC2具有潛在的miR-21結合位點。用miR-21
10、mimic模擬miR-21高表達,雙熒光素酶報告分析786-O和A498細胞株中miR-21高表達對CASC2表達水平的影響,進而檢測CASC2對786-O和A498的腫瘤抑制作用是否受miR-21干擾影響。
結果:
通過生物信息學分析CASC2具有miR-21的結合位點。雙熒光素酶報告基因分析確認在CASC2-WT質(zhì)粒轉染組,miR-21高表達可以明顯抑制相應的熒光活性,而在突變組(CASC2-MUT) miR-2
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