pcDNA-,3--β-NGF重組載體轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因小鼠BMSCs的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建人β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因(β-NGF)的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3-β-NGF，探討綠色熒光蛋白(Greenflurescentprotein,GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)體外培養(yǎng)和純化方法，進(jìn)一步觀察人pcDNA3-β-NGF重組載體在GFP轉(zhuǎn)基因小鼠BMSCs中的表達(dá)。 方法：采用RT-PCR方法從人腦腫瘤旁組織的mRNA中擴(kuò)增人β

2、-NGF的基因片段，將片段和真核表達(dá)載體pcDNA3同時(shí)經(jīng)HindⅢ和ApaI雙酶切、純化、連接、轉(zhuǎn)化及篩選，從而構(gòu)建重組載體pcDNA3-β-NGF。經(jīng)酶切和測(cè)序?qū)χ亟M體進(jìn)行分析和鑒定。 分離GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞直接種植在培養(yǎng)瓶中，分別于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h進(jìn)行首次全量換液，在3d按細(xì)胞類型對(duì)貼壁細(xì)胞分別計(jì)數(shù)并用CD44、CD45、CD54進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。此外，選4

3、h、8h、24h后換液的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在傳第5代時(shí)，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)，用CD44、CD45、CD54進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 用已構(gòu)建的pcDNA3-β-NGF重組載體轉(zhuǎn)染第5代的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠BMSCs，經(jīng)G418篩選，用Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)其表達(dá)。 結(jié)果：RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果顯示：在預(yù)期位置有陽(yáng)性條帶。重組載體經(jīng)酶切、測(cè)序等分析插入的基因片段為表達(dá)β-NGF的基因。在原代培養(yǎng)中，

4、隨著首次換液時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞密度增多，BMSCs比例減少；2～4h首次換液細(xì)胞的純度高而數(shù)目少，在16h后換液細(xì)胞的數(shù)目多而純度降低；在8～10h首次換液的細(xì)胞純度及數(shù)量均較高，傳代后生長(zhǎng)擴(kuò)增情況好于其他時(shí)段換液的細(xì)胞。Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)表明pcDNA3-β-NGF重組載體能在BMSCs中表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空載體及陰性對(duì)照組均無或較弱的表達(dá)。 結(jié)論：人β-NGF基因重組真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3-β-