pcdna3.1pres1gfp重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在小鼠精子內(nèi)的表達

1、p c D N A 3 ．卜p r e S l 一G F P 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在小鼠精子內(nèi)的表達摘要目的構(gòu)建含有綠色熒光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，G F P ) 基因與乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sB v i r u s ，H B V ) p r e S l 基因的重組真核表達載體p c D N A 3 ．1 - p r e S l 一G F

2、 P ，觀察并檢測該重組質(zhì)粒在小鼠精子內(nèi)的表達。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ，P C R ) 方法，以p B R 3 2 2 ．H B V質(zhì)粒為模板擴增H B Vp r e S l 基因片段，將P C R 擴增得到的H B V p r e S l 基因片段與含有G F P 的真核表達載體p c D N A 3 ．1 ．G F P 分別進行E c o

3、RI 和X b a I 雙酶切，以T 4連接酶過夜連接，經(jīng)酶切及測序鑒定后，用脂質(zhì)體L i p o f e c t a m i n e T M 2 0 0 0 轉(zhuǎn)染小鼠精子，在熒光顯微鏡下觀察G F P 有無表達，并應(yīng)用P C R 檢測H B V p r 西J 『基因的存在。結(jié)果①利用D N A 重組技術(shù)將p r e S l 基因插入到p c D N A 3 ．1 一G F P 質(zhì)粒中，經(jīng)雙酶切及測序鑒定，成功構(gòu)建了p c D N A

4、3 ．1 一p r e S l 一G F P 真核表達載體；②將重組質(zhì)粒按一定比例轉(zhuǎn)染小鼠精子后，在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染精子頭部有較明亮的綠色熒光；③提取轉(zhuǎn)染精子D N A ，經(jīng)P C R 擴增得到位于H B V p r e S l 基因區(qū)域內(nèi)長約5 8 9 b p 的片段，與預(yù)期一致。結(jié)論①以上研究結(jié)果證實，重組質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 ．p r e S l ．G F P 已得到成功構(gòu)建，這為建立新型H B V 垂直傳遞小鼠

5、模型提供了可能；②重組真核表達載體p c D N A 3 ．1 一p r e S l 一G F P 在小鼠精子內(nèi)的表達，表明重組質(zhì)粒p c D N A 3 ．1 - p r e S l - G F P 可用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠，同時G ．即還可作為H B V p r e S l 基因存在與否的報告基因。因此本研究為建立新的H B V 垂直傳遞小鼠模型，進而更好地研究H B V 的垂直傳播機制奠定了實驗基礎(chǔ)。碩士研究生：指導(dǎo)教師：李茜( 遺傳

6、學(xué))王培林教授關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒；重組質(zhì)粒；綠色熒光蛋白；小鼠精子；轉(zhuǎn)染目錄弓l 言?????????????????????????????????????????????．1第l 章材料與方法????????????????????????????31 ．1 研究對象??????????????????????????????·31 ．2 試劑與材料?????????????????????????????”31 ．3

7、器材及其來源????????????????????????????．51 ．4 方法???????????????????????????????????????????6第2 章結(jié)果2 ．1 p c D N A 3 ．1 一p r e S l 一G F P 重組載體鑒定???????????????????1 42 ．2 轉(zhuǎn)染前后精子活力評估結(jié)果??????????????????????1 62 ．3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染精子后綠色熒光的

8、鑒定??????????????????1 62 ．4 轉(zhuǎn)染后精子D N A 內(nèi)p r e S l 的檢測與表達????????????????·1 7第3 章討論????一 1 93 ．1H B V 的垂直傳遞??????????????????????????“1 93 ．2p c D N A 3 ．1 一p r e S l ·G F P 重組載體的構(gòu)建?????????????????·1 93 ．3