隔日限食療法對(duì)大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察隔日限食療法（every-other-day fasting，EODF）對(duì)大鼠急性脊髓損傷（acute spinal cord injury,ASCI）后運(yùn)動(dòng)功能、脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎性因子及血清炎性因子的影響，了解神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)之間的關(guān)系，從抗凋亡、抗炎方面初步探討EODF對(duì)ASCI的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制。為EODF用于臨床治療ASCI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：將48只雌性成年Wistar大鼠

2、，隨機(jī)分成EODF組（A組，n=16）、正常飲食對(duì)照組（B組，n=16）、假手術(shù)組（C組，n=16）。采用改良Aleln's打擊法建立Wistar大鼠胸段脊髓損傷模型。A組于術(shù)后立即給予EODF，B組及C組給予正常飲食。各組大鼠分別于術(shù)后6h、1d、3d、7d行動(dòng)物行為學(xué)BBB評(píng)分(Basso Beattie and Bresnahan scores，BBB scores)觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能變化后處死，取損傷段脊髓組織行石蠟切片后，通過蘇

3、木素-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色來觀察脊髓組織結(jié)構(gòu)變化，并通過免疫組化檢測(cè)（SP法）觀察凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)情況，觀察炎性因子白介素-6（Interleukin-6，IL-6)、白介素-10（Interleukin-10，IL-10)的表達(dá)情況；運(yùn)用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中IL-6、IL-10的含量。
　　結(jié)果：
　　1.行為學(xué)觀察結(jié)果：脊髓損傷后6h，A、

4、B兩組均表現(xiàn)出雙后肢癱瘓的嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)功能障礙，BBB評(píng)分均為0.00±0.00，與 C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，A、B兩組BBB評(píng)分均呈上升趨勢(shì)，在脊髓損傷3d后，A、B兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），A組出現(xiàn)后肢三個(gè)關(guān)節(jié)（髖、膝、踝關(guān)節(jié)）的輕微活動(dòng)，BBB評(píng)分為4.00±0.82，而 B組僅出現(xiàn)髖、膝一到兩個(gè)關(guān)節(jié)的輕微活動(dòng)，評(píng)分為1.75±0.50；至脊髓損傷7d后，A、B兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

5、＜0.01），A組可見足底負(fù)重位及足背負(fù)重步行，BBB評(píng)分為9.00±0.82，而B組僅見兩個(gè)關(guān)節(jié)輕微活動(dòng)及一個(gè)關(guān)節(jié)的較大幅度活動(dòng)，BBB評(píng)分為5.50±1.29。
　　2.HE染色結(jié)果：A、B兩組經(jīng)造模后脊髓組織均可見不同程度的出血灶、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及空洞形成，可見明顯的神經(jīng)細(xì)胞變性，灰白質(zhì)界限欠清；較之于B組，A組經(jīng)EODF干預(yù)后病理學(xué)改變可見改善；C組脊髓結(jié)構(gòu)規(guī)則，灰白質(zhì)界限分明，白質(zhì)致密，無明顯出血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

6、r>　　3.免疫組化結(jié)果：
　?。?）Caspase-3、Bax：脊髓損傷6h后，與C組比較，A、B兩組Caspase-3表達(dá)（分別為34.67±0.98，35.94±3.17）及Bax表達(dá)（分別為39.09±0.82，40.16±1.09）均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，A、B兩組Caspase-3及Bax表達(dá)均呈先升后降趨勢(shì)，峰值均出現(xiàn)在1d，在脊髓損傷3d后，A組Caspase-3、Bax表達(dá)均值（

7、26.87±0.77，37.93±0.84）小于B組（31.47±1.56，39.69±0.88），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；至脊髓損傷7d后，A組Caspase-3、Bax表達(dá)均值（21.75±0.99，31.36±1.90）明顯小于B組（31.43±2.09，39.01±1.65），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示 EODF可減少脊髓組織中Caspase-3、Bax的表達(dá)。
　?。?）Bcl-2：與C組比較，脊髓

8、損傷6h后，A、B兩組Bcl-2表達(dá)（分別為12.05±1.12，10.78±0.72）均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，A、B兩組Bcl-2表達(dá)均呈先升后降趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在3d，在脊髓損傷1d、3d、7d后，A組Bcl-2表達(dá)均值（27.25±0.85，37.11±0.57，31.53±0.82）均大于B組（20.41±0.75，25.23±0.71，22.23±0.97），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提

9、示EODF可增加脊髓組織中Bcl-2的表達(dá)。
　　（3）IL-6：脊髓損傷6h后，A、B兩組IL-6表達(dá)（分別為31.30±2.57，31.64±1.73）與C組比較均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，A組IL-6表達(dá)呈先升后降趨勢(shì)，峰值在1d，B組IL-6表達(dá)呈上升趨勢(shì)，在脊髓損傷3d、7d后，A組IL-6表達(dá)均值（28.41±1.68,27.09±1.34）小于B組（34.64±2.69,35.16±2.

10、75），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示EODF可減少脊髓組織中IL-6的表達(dá)。
　　（4）IL-10：與C組比較，脊髓損傷6h后，A、B兩組IL-10表達(dá)（分別為15.98±0.88，15.60±1.33）均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，A、B兩組IL-10表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，在脊髓損傷1d后，A組IL-10表達(dá)均值（17.62±0.85）大于B組（16.39±1.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.

11、05）；至脊髓損傷3d、7d后，A組IL-10表達(dá)均值（20.47±1.87，16.75±1.70）大于B組（23.51±1.85，17.13±1.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示EODF可增加脊髓組織中IL-10的表達(dá)。
　　4.血清IL-6、IL-10含量的ELISA結(jié)果：
　?。?）IL-6：脊髓損傷6h后，A、B兩組血清IL-6含量（分別為87.07±3.72，87.77±4.41）與C組比較均明顯增加

12、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，A、B兩組血清IL-6含量呈先升后降趨勢(shì)，A組峰值在1d，B組峰值在3d，在脊髓損傷3d、7d后，A組血清IL-6含量均值（101.56±8.55,51.42±6.29）小于B組（121.79±4.69,108.24±4.56），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示EODF可減少血清IL-6的產(chǎn)生。
　　（2）IL-10：脊髓損傷6h后，A、B兩組血清IL-10含量（分別為21.8

13、3±0.27，21.71±0.64）與C組比較均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，A、B兩組血清IL-10含量均呈上升趨勢(shì)，在脊髓損傷3d、7d后，A組血清IL-10含量均值（29.11±0.54,34.41±0.57）小于B組（25.76±0.64,26.12±1.61），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示EODF可減少血清IL-10的產(chǎn)生。
　　5. EODF組相關(guān)性分析結(jié)果：Caspase-3、Ba

14、x、脊髓IL-6陽性細(xì)胞表達(dá)及血清IL-6與BBB評(píng)分之間均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.756、-0.730、-0.774、-0.734，P＜0.01）；Bcl-2、脊髓 IL-10陽性細(xì)胞表達(dá)及血清 IL-10與 BBB評(píng)分之間均呈正相關(guān)（r=0.899、0.933、0.951，P＜0.01）；脊髓IL-6陽性細(xì)胞表達(dá)與血清IL-6含量之間呈正相關(guān)（r=0.636，P＜0.01）；脊髓組織IL-10陽性細(xì)胞表達(dá)與血清IL-10含量之間呈正相關(guān)