抗砷載體的構(gòu)建以及在喜溫硫桿菌中的接合轉(zhuǎn)移.pdf

1、細(xì)菌氧化法是用細(xì)菌來促進(jìn)硫化礦氧化的濕法冶金過程，同化學(xué)冶金相比較，有對(duì)環(huán)境污染小、耗能低、浸礦成本低等優(yōu)勢(shì)，尤其對(duì)處理低品位礦石，具有很大的潛力?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)的富礦越來越少，開采貧礦的任務(wù)顯得日益重要，但是傳統(tǒng)焙燒以及化學(xué)方法都具有對(duì)環(huán)境污染大、設(shè)備要求高、提取率低和生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)，因此細(xì)菌氧化法越來越廣泛地應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，目前世界上已經(jīng)有十余家大規(guī)模金礦廠利用細(xì)菌氧化法對(duì)含硫金礦進(jìn)行預(yù)處理。 能夠進(jìn)行生物浸礦的微生物主要是一

2、些在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)的鐵或硫氧化細(xì)菌。開始以為最適生長(zhǎng)溫度在30℃左右的氧化硫硫桿菌、氧化亞鐵硫桿菌等在浸礦中起主要作用?？墒墙陙韺?duì)連續(xù)反應(yīng)浸礦系統(tǒng)微生物種群研究的結(jié)果顯示，一些最適生長(zhǎng)溫度為40℃～50℃的中度嗜熱細(xì)菌，如喜溫硫桿菌、氧化亞鐵鉤端螺旋菌等是浸礦細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌群，在浸礦過程中具有重要作用。通過研究喜溫硫桿菌和鐵氧化細(xì)菌混合培養(yǎng)對(duì)浸礦的影響，發(fā)現(xiàn)喜溫硫桿菌能夠顯著提高這些鐵氧化細(xì)菌的浸礦效率，進(jìn)一步解釋和確認(rèn)了喜溫硫桿菌在

3、生物浸礦中的作用。 喜溫硫桿菌是1994年新命名的菌株。喜溫硫桿菌具有嗜熱、嗜酸的特性，為G-，端生鞭毛，運(yùn)動(dòng)、嚴(yán)格好氧，專性自養(yǎng)硫氧化細(xì)菌，短桿狀0.7×1.2um。以硫或者硫的復(fù)合物作為能源，在含有硫代硫酸鈉和四硫酸鉀的固體培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)。菌落圓形，表面光滑、透明，在菌落中央有硫的沉淀。生長(zhǎng)最適溫度為45℃，在32-58℃范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)。生長(zhǎng)最適pH為2.0-2.5。 在處理含砷難冶黃鐵礦時(shí)由于貧礦含砷高，抑制了浸礦

4、細(xì)菌生長(zhǎng)，因此迫使人們用遺傳學(xué)的方法改造浸礦菌株，構(gòu)建具有較高抗砷能力的工程菌株，以適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)的需要。喜溫硫桿菌自從1994年首次報(bào)道以來，國(guó)外的大量工作集中在它的生理學(xué)和在浸礦中的作用方面，未見有對(duì)其遺傳改造方面的報(bào)道，國(guó)內(nèi)關(guān)于喜溫硫桿菌的研究開展比較晚，尚處于起步階段。 本實(shí)驗(yàn)室從云南騰沖分離到一株中度嗜熱嗜酸硫氧化桿菌MTH-04，通過對(duì)其進(jìn)行生理生化特性研究和16SrDNA序列分析確定與喜溫硫桿菌為同一類群。本實(shí)驗(yàn)利用

5、DNA體外重組技術(shù)，將大腸桿菌質(zhì)粒載體pUM3上的抗砷基因簇片段亞克隆到含有強(qiáng)啟動(dòng)子(tac啟動(dòng)子)并具有廣泛寄主范圍特性的IncQ族質(zhì)粒pMMB24上，構(gòu)建了含有強(qiáng)啟動(dòng)子、可在tra基因誘動(dòng)下轉(zhuǎn)移的抗砷質(zhì)粒pSDRA3以及刪除調(diào)節(jié)基因片段后的組成型表達(dá)抗砷質(zhì)粒pSDRA4。E.coliSM10菌株染色體上整合有RP4質(zhì)粒的tra基因，可推動(dòng)含有mob位點(diǎn)的非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。將重組質(zhì)粒pSDRA3、pSDRA4引入大腸桿菌SM1

6、0中，然后以SM10(pSDRA3)和SM10(pSDRA4)作為供體菌，野生型喜溫硫桿菌MTH-04作為受體菌在濾膜上進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。然后在抗生素選擇平板上篩選接合轉(zhuǎn)移子。接合轉(zhuǎn)移頻率分別為(1.095±0.662)×10-5和(1.444±0.797)×10-4。 進(jìn)一步以喜溫硫桿菌MTH-04(pSDRA3)、MTH-04(pSDRA4)作為供體菌，以大腸桿菌C600作為受體菌，C600(RP4)作為輔助菌進(jìn)行反向接合實(shí)驗(yàn)，

7、在相應(yīng)的抗生素平板上篩選得到接合轉(zhuǎn)移子。對(duì)反向接合轉(zhuǎn)移子提取質(zhì)粒驗(yàn)證，與pSDRA3、pSDRA4相同。質(zhì)粒上的抗生素基因均獲得表達(dá)。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)質(zhì)粒確實(shí)通過接合轉(zhuǎn)移方式從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到了喜溫硫桿菌中。 質(zhì)粒在菌體細(xì)胞中的穩(wěn)定性是衡量所構(gòu)建的工程菌的一個(gè)重要指標(biāo)，直接關(guān)系到基因工程菌的應(yīng)用前景，只有穩(wěn)定性高的質(zhì)粒，才能隨著菌體的生長(zhǎng)而比較穩(wěn)定地遺傳，從而保證應(yīng)用過程中的穩(wěn)定性。因此我們對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，在

8、無選擇壓力條件下連續(xù)傳代50次基本保持穩(wěn)定，重組質(zhì)粒pSDRA3、pSDRA4分別保留81％和76％以上。經(jīng)抗砷性能檢測(cè)，與野生菌相比，構(gòu)建的喜溫硫桿菌工程菌MTH-04(pSDRA3)、MTH-04(pSDRA4)抗砷能力明顯提高，分別從10mmol/L提高到35mmol/L和45mmol/L。 本實(shí)驗(yàn)首次成功地建立了大腸桿菌與喜溫硫桿菌的遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，不僅為用遺傳工程手段改造浸礦中使用的工業(yè)菌株提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法，為以后喜