FasL質(zhì)粒載體構(gòu)建及在小鼠心臟移植中抗排斥反應(yīng)的研究.pdf

1、本課題構(gòu)建FasL真核表達(dá)質(zhì)粒載體，通過體外轉(zhuǎn)染供體小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞，探討誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)理。研究經(jīng)FasL轉(zhuǎn)染的供體來源的樹突狀細(xì)胞在小鼠心臟移植中對移植物的保護(hù)作用機(jī)制。并為進(jìn)一步研究FasL基因在移植排斥中的保護(hù)作用打下基礎(chǔ)。 第一部分FasL基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建目的構(gòu)建攜帶小鼠FasL基因的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞(Dendriticcell，DC)做準(zhǔn)備。方法采用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、Not

2、Ⅰ雙酶切P43-FasL質(zhì)粒，將C57小鼠FasL基因切下后，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pTracer連接，連接產(chǎn)物在DH5α大腸桿菌中擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并對陽性克隆的基因進(jìn)行測序。結(jié)果酶切鑒定FasL基因成功正向插入pTracer質(zhì)粒載體，經(jīng)測序，克隆的基因與Genbank提供的C57小鼠FasL基因序列完全相同。結(jié)論以雙酶切法成功構(gòu)建pTracer質(zhì)粒為骨架的小鼠FasL真核表達(dá)載體，為深入研究FasL生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)

3、。 第二部分FasL轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡的實驗研究目的制備穩(wěn)定表達(dá)FasL蛋白的小鼠骨髓源DC并探討其體外誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)理。方法采用培養(yǎng)基選擇法體外培養(yǎng)小鼠骨髓源DC，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染FasL基因至小鼠成熟DC，熒光實時定量PCR和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后FasLmRNA及蛋白的表達(dá)?；旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)，MTT法檢測DC對T淋巴細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡的能力。結(jié)果經(jīng)體外培養(yǎng)，每只小鼠可

4、獲1.5-2×107骨髓源DC，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FasL的DC較未轉(zhuǎn)染DC，F(xiàn)asLmRNA表達(dá)明顯升高，在未轉(zhuǎn)染DC，轉(zhuǎn)染pTracer質(zhì)粒DC和轉(zhuǎn)染pTracer-FasL質(zhì)粒的DC，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)分別為5.59％，7.96％和35.77％?；旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，F(xiàn)asL轉(zhuǎn)染后DC對T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)明顯下降(P＜0.01)，且誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡的能力明顯增加(P＜0.01)。結(jié)論培養(yǎng)基選擇法可收獲大量骨髓源DC，具有典型形態(tài)，高

5、表達(dá)MHCⅡ和共刺激分子，所獲骨髓源DC能激活初始型T細(xì)胞免疫應(yīng)答。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FasL基因至小鼠骨髓源DC，可以使DC高表達(dá)FasL蛋白。轉(zhuǎn)染FasL的DC體外刺激異系T淋巴細(xì)胞增殖的能力下降，且能明顯誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。 第三部分FasL轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞輸注對心臟移植抗排斥反應(yīng)的研究目的探討FasL轉(zhuǎn)染供體小鼠骨髓源DC后輸注對移植物的保護(hù)作用及抗排斥機(jī)理。方法建立小鼠異位心臟移植模型，術(shù)前7天靜脈輸注轉(zhuǎn)染FasL的DC，同

6、時設(shè)立異系對照組、CsA治療組、同系對照組、未轉(zhuǎn)染DC組。觀察各組移植心臟存活時間，評定術(shù)后7天移植物排斥反應(yīng)病理分級。進(jìn)一步，TdT介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測轉(zhuǎn)染FasL的DC、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒DC和未轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)脾臟中T淋巴細(xì)胞凋亡。結(jié)果成功構(gòu)建穩(wěn)定的小鼠異位心臟移植模型。在轉(zhuǎn)染FasL的DC組中，移植心中位生存時間為22天，明顯長于異系對照組9天和未轉(zhuǎn)染DC組8天(P＜0.01)，排斥反應(yīng)的病理分級也顯著低于異系對照組和未轉(zhuǎn)