基于iTRAQ-2DLC-MS-MS技術(shù)的肺結(jié)核證候血清特異性蛋白質(zhì)篩選及肺結(jié)核病潛在標(biāo)志物研究.pdf

1、本文主要講述了以下幾個方面：
　　第一部分 基于iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)的肺結(jié)核病證候特異性蛋白質(zhì)的篩選及其臨床病理分析
　　目的:肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis，TB)是單一感染因素引起死亡人數(shù)最多的傳染病。目前，肺結(jié)核病的治療以西醫(yī)治療為主，以常規(guī)西醫(yī)抗結(jié)核方案治療方法用藥6個月。這種治療方法，易產(chǎn)生耐藥性肺結(jié)核和藥物毒副作用，如異煙肼、利福平和吡嗪酰胺均具有嚴(yán)重的肝毒性，嚴(yán)重者可以

2、導(dǎo)致肝功能衰竭或患者死亡。因此，部分患者不得不中斷治療，增加了肺結(jié)核復(fù)發(fā)，以及耐藥肺結(jié)核病的產(chǎn)生。中醫(yī)將肺結(jié)核病分為肺陰虛證(pulmonary Yin deficiency syndrome，PYD)、陰虛火旺證(hyperactivity of fire due to Yin deficiency syndrome，HFYD)、氣陰兩虛證(deficiency of Qi and Yin syndrome，DQY)和陰陽兩虛證(de

3、ficiencyof Yin and Yang syndrome，DYY)四證。根據(jù)不同證候采用不同的方藥治療，對抑制結(jié)核分枝桿菌、提高機體免疫、降低西醫(yī)抗結(jié)核藥物毒副作用、減輕肺結(jié)核中毒癥狀等具有較好的療效。但由于中醫(yī)證候分型受中醫(yī)師的臨床經(jīng)驗、學(xué)識等主觀因素影響較大，且缺乏相應(yīng)的科學(xué)基礎(chǔ)研究，缺乏客觀的檢測方法。因此，極大地影響了中西醫(yī)結(jié)合治療肺結(jié)核病的臨床應(yīng)用。
　　方法:根據(jù)中醫(yī)辨證，將肺結(jié)核病患者分為肺陰虛證、陰虛火旺證

4、、氣陰兩虛證和陰陽兩虛證四證。采集214例肺結(jié)核病患者血清，采用生物信息學(xué)方法分析肺結(jié)核中醫(yī)證候的臨床病理特點和證候轉(zhuǎn)歸規(guī)律;采用iTRAQ穩(wěn)定同位素標(biāo)記，聯(lián)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS)技術(shù)篩選并鑒定肺結(jié)核中醫(yī)證候的血清差異蛋白質(zhì);再通過擴大樣本量，通過ELISA法進(jìn)行驗證。此外，本實驗3年內(nèi)僅收集到5例陰陽兩虛證證患者，樣本量不足以納入后續(xù)實驗。
　　結(jié)果:本實驗發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病肺陰虛證患者以結(jié)核結(jié)節(jié)、條索、斑片狀

5、影等增生性病變?yōu)橹?陰虛火旺證患者以空洞、干酪樣壞死等變質(zhì)性病變?yōu)橹鳎冑|(zhì)性病變發(fā)生率顯著升高（P=0.0427）;氣陰兩虛證患者以重癥肺結(jié)核病為主，具有多種肺部損傷，患者粟粒性病變發(fā)生率顯著升高（P=0.0013），此外，氣陰兩虛證患者血沉值顯著高于肺陰虛和陰虛火旺證患者(P=0.0178)。治療后，36例治愈患者中，94.44％的初治肺結(jié)核病患者（12例肺陰虛證、18例陰虛火旺證、4例氣陰兩虛證）向肺陰虛證轉(zhuǎn)歸，且患者血沉顯著下降，

6、病灶明顯吸收，空洞閉合。蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明，共有39個差異蛋白質(zhì)在肺結(jié)核證候之間表現(xiàn)出顯著差異。臨床大樣本驗證結(jié)果顯示，γ-谷氨酰水解酶(GGH)、IgG3恒定區(qū)(IGHG3)、觸珠蛋白(HPT)分別在肺結(jié)核病肺陰虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證中特異性高表達(dá)（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01）。并且，肺陰虛證患者GGH含量顯著高于陰虛火旺證和氣陰兩虛證（P＜0.01，P＜0.001），陰虛火旺證患者IGHG3含量顯著高于肺陰

7、虛證和氣陰兩虛證(P＜0.001，P＜0.01)。
　　結(jié)論:(1)通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病證候與患者病理變化和血沉密切相關(guān)。(2)通過iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)和ELISA驗證，獲得了GGH、IGHG3和HPT分別為肺結(jié)核證肺陰虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證的血清特異性蛋白質(zhì)。(3)本實驗為肺結(jié)核病中醫(yī)證候提供了新生物學(xué)研究基礎(chǔ)，為肺結(jié)核病證候的病理改變提供了實驗依據(jù)。
　　第二部分 基于iTRAQ-2D

8、LC-MS/MS技術(shù)的肺結(jié)核病潛在蛋白質(zhì)標(biāo)志物研究
　　目的:肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性傳染病，隨著HIV合并肺結(jié)核病和耐多藥肺結(jié)核病的產(chǎn)生，肺結(jié)核病對人類健康帶來了極大威脅。中國是肺結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的國家之一，位居全球第2位。肺結(jié)核病診斷的延遲可能會使疾病的嚴(yán)重程度、死亡率和傳染風(fēng)險增加。因此，早發(fā)現(xiàn)、

9、早診斷、早治療，是控制肺結(jié)核病傳播的重要因素，是遏制肺結(jié)核病流行趨勢的主要手段。臨床上，肺結(jié)核病的診斷主要依賴痰涂、痰培養(yǎng)、胸透(X-ray/CT)和臨床癥候?qū)W等方法，痰涂檢測陽性率低下，痰培養(yǎng)檢查耗時太長，胸透(X-ray/CT)和臨床癥候?qū)W診斷方法特異性差，易與肺炎、慢性阻塞性肺炎(COPD)等肺部疾病混淆。尋找快速、高效的肺結(jié)核病診斷標(biāo)志物已成為控制肺結(jié)核病的研究重點。
　　方法:本實驗共納入423例受試者。其中，初治活動性

10、肺結(jié)核病患者138例，健康獻(xiàn)血者67例，肺炎患者73例，COPD患者73例，治療后肺結(jié)核病患者72例。采用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)比較初治肺結(jié)核病、正常人、肺炎、COPD患者的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，篩選和鑒定初治肺結(jié)核病的血清差異蛋白質(zhì)，并用ELISA法進(jìn)行大樣本驗證。采用生物信息學(xué)方法分析患者的臨床檢測特征，分析特異性蛋白質(zhì)與臨床檢測結(jié)果的相關(guān)性。并通過邏輯回歸分析，建立蛋白質(zhì)診斷模型，通過ROC曲線法分析該蛋白質(zhì)模型的準(zhǔn)確性、

11、特異性和靈敏度。
　　結(jié)果:通過與正常人比較，獲得了79個肺結(jié)核病顯著差異蛋白質(zhì)，其中47個蛋白質(zhì)同時還與肺炎、COPD患者有顯著差異。初治肺結(jié)核病患者(n=138)血清淀粉樣蛋白A(SAA)、維生素K依賴蛋白Z(PROZ)、補體C4b結(jié)合蛋白質(zhì)β鏈(C4BPB)含量均顯著高于正常人(n=67)（P＜0.0001，P＜0.0001，P＜0.0001），顯著低于肺炎患者(n=73)（P＜0.0001，P＜0.0001，P＜0.000

12、1）和COPD患者(n=73)（P＜0.0001，P＜0.0001，P=0.0016）。6個月治療后，治療后肺結(jié)核病患者(n=72)SAA和PROZ含量顯著升高（P=0.022，P＜0.0001），C4BPB含量顯著降低（P=0.0038），但仍與正常人有顯著差異(P＜0.0001)。還發(fā)現(xiàn)，空洞型肺結(jié)核病患者SAA和PROZ含量顯著高于非空洞患者（P=0.006，P=0.03），雙肺損傷的肺結(jié)核病患者SAA含量顯著高于單肺損傷患者(P

13、=0.003)，痰涂陽性患者SAA含量顯著高于痰涂陰性患者（P=0.02）。臨床分析結(jié)果顯示初治肺結(jié)核病患者許多凝血指標(biāo)和血脂指標(biāo)均與正常人、肺炎、COPD、治療后TB有顯著差異（P＜0.05）。相關(guān)性分析顯示，初治TB患者PROZ與國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)有顯著相關(guān)性(rs=0.414，P=0.044)，C4BPB與血漿纖維蛋白原(FIB)有顯著相關(guān)性(rs=0.617，P=0.0002)。受試者工作特征曲線(Receiver ope

14、rating characteristic curve，ROC)曲線分析結(jié)果顯示SAA、PROZ和C4BPB組成的診斷模型，從正常人、肺炎、COPD和治療后肺結(jié)核病患者中診斷初治肺結(jié)核病的曲線下面積(Area under the ROCcurve，AUC)值分別為0.971、0.895、0.895和0.872。
　　結(jié)論:(1)本實驗通過iTRAQ-2DLC-MS/MS和ELISA技術(shù)獲得了3個初治肺結(jié)核病潛在診斷標(biāo)志物（SAA、

15、PROZ和C4BPB）。(2)由SAA、PROZ和C4BPB組成的蛋白質(zhì)模型從正常人、肺炎、COPD和治療后肺結(jié)核病患者中診斷初治肺結(jié)核病具有良好效果，其AUC值分別為0.971、0.895、0.895和0.872。(3)通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)初治肺結(jié)核病患者臨床凝血檢測結(jié)果異常，發(fā)現(xiàn)特異性蛋白質(zhì)PROZ與凝血檢測指標(biāo)INR存在顯著正相關(guān)，C4BPB與FIB存在顯著正相關(guān)。但是PROZ和C4BPB具體如何參與肺結(jié)核病患者的凝血異常還有