運用2d-LC-MS-MS結(jié)合iTRAQ技術(shù)篩選人肺腺癌質(zhì)膜蛋白質(zhì)標(biāo)志物.pdf

1、肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的首位，且其發(fā)病率將在相當(dāng)長時期內(nèi)呈顯著上升趨勢。按照組織學(xué)分類，肺癌一般分成鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌四種類型，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma)約占全部肺癌的20-30％。近年來，肺腺癌的發(fā)病率呈逐步上升，且患者預(yù)后差、死亡率高，其5年生存率不超過16％。究其原因，主要是因為肺腺癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者首次就診時就已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，失

2、去了最佳治療時機(jī)。即使手術(shù)后，多數(shù)患者仍會死于肺腺癌復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所以，肺腺癌早期診斷和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測對于肺腺癌防治具有重要作用。理論上，標(biāo)志物(biomarkers)是腫瘤診斷和病情監(jiān)測最敏感的指標(biāo)。因此，尋找新的肺腺癌標(biāo)志物，是提高腫瘤患者治愈率與生存率的有效手段，并對于肺腺癌的診斷和治療具有重要意義。
　　為篩選肺腺癌標(biāo)志物，本研究利用臨床診斷選取肺腺癌組織和癌旁正常肺組織為研究對象，首先采用差速離心、蔗糖密度梯度離心(su

3、crosedensity centrifugation)聯(lián)合雙水相法(aqueous two-phase partition)純化組織細(xì)胞質(zhì)膜，然后運用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tag forrelative and absolute quantitation，iTRAQ)標(biāo)記技術(shù)結(jié)合二維液相色譜(twodimensional liquid chromatography,2D-LC)-串聯(lián)質(zhì)譜(tandem Mass

4、Spectrometry, MS/MS)分離鑒定肺腺癌組織和癌旁正常肺組織的差異質(zhì)膜蛋白質(zhì)。再用蛋白質(zhì)印記(western blot)驗證部分差異質(zhì)膜蛋白質(zhì)FLOT1(Flotillin-1)，CAV1(Caveolin-1)和ITGB1(Integrinβ1)在肺腺癌組織和癌旁正常肺組織的表達(dá)情況，最后運用免疫組織化學(xué)(immuno-histochemistry)染色檢測FLOT1，CAV1和ITGB1三個差異質(zhì)膜蛋白質(zhì)在存擋的石蠟包

5、埋肺腺癌組織中的表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)分析FLOT1，CAV1和ITGB1的表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理因素及患者復(fù)發(fā)和預(yù)后的關(guān)系。
　　本研究不僅建立了一種差速離心、蔗糖密度梯度離心結(jié)合雙水相純化肺腺癌組織質(zhì)膜的方法，而且發(fā)展了一個有利質(zhì)膜蛋白質(zhì)分離鑒定的iTRAQ-2D LC-MS/MS研究策略。41個差異蛋白質(zhì)（含36個差異質(zhì)膜蛋白）得到準(zhǔn)確鑒定，與癌旁正常肺組織相比，18個蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，23個蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中表達(dá)下調(diào)

6、。Western blot驗證結(jié)果顯示:FLOT1和ITGB1在肺腺癌組織中較癌旁正常肺組織中表達(dá)升高，CAV1在肺腺癌組織中較癌旁正常肺組織中表達(dá)降低。免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步證實:FLOT1和ITGB1在肺腺癌組織中較癌旁正常肺組織中表達(dá)上調(diào)，CAV1在肺腺癌組織中較癌旁正常肺組織中表達(dá)下調(diào)。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn):FLOT1，ITGB1和CAV1的表達(dá)水平與肺腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。Kaplan-Meier曲線和Cox回歸分析進(jìn)

7、一步證明，F(xiàn)LOT1，ITGB1，CAV1的表達(dá)水平與肺腺癌患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)，即FLOT1，ITGB1和CAV1高表達(dá)的肺腺癌易復(fù)發(fā)，且生存率低，預(yù)后差。FLOT1，ITGB1和CAV1高表達(dá)是肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的危險因子及獨立的預(yù)后因子。
　　本研究首次應(yīng)用蔗糖密度梯度離心結(jié)合雙水相純化質(zhì)膜，iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合2D-LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)分析正常肺組織和肺腺癌組織差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，首次報道FLOT1的表達(dá)水平與肺腺癌患