肺結(jié)核病生物學(xué)標(biāo)志物的篩選與鑒定及易感基因研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 非耐藥肺結(jié)核病生物學(xué)標(biāo)志物的篩選與鑒定
　　結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）引起的慢性傳染性疾病，以肺部結(jié)核最為常見。臨床普遍應(yīng)用的肺結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)為痰細(xì)菌學(xué)檢測，診斷時間須4-8周。為此，無法早期控制傳染源，導(dǎo)致肺結(jié)核病發(fā)病率和死亡率的上升。目前，尚無肺結(jié)核病的生物學(xué)標(biāo)志物，無法建立高效的

2、診斷肺結(jié)核病的新方法。
　　方法:本研究收集血清431例，其中150例健康對照、131例非耐藥肺結(jié)核病患者、91例抗結(jié)核藥物治療2個月患者、59例抗結(jié)核藥物治療6個月以上（治愈）患者。我們通過iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa測序技術(shù)篩選了非耐藥肺結(jié)核病患者初診、治愈組和健康對照組各10例樣本，分析血清蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的生物學(xué)標(biāo)志物的差異。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent

3、assay，ELISA)和熒光定量PCR大樣本驗證選取的差異蛋白質(zhì)和miRNAs。通過ROC曲線分析、Logistic回歸模型，建立非耐藥肺結(jié)核病的潛在診斷乃至療效評價模型。
　　結(jié)果:通過iTRAQ-2D LC-MS/MS技術(shù)，在初診非耐藥肺結(jié)核病患者中，發(fā)現(xiàn)了35個和健康對照、抗結(jié)核治療后均差異的蛋白質(zhì);通過Solexa測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)同趨勢改變的miRNAs64個。以健康對照組為參照，初診未用藥和抗結(jié)核治愈的肺結(jié)核病患者之間，存

4、在差異最大的Gene Ontology分類是:代謝途徑(13);細(xì)胞器(13)和催化活性(7)。差異蛋白質(zhì)多存在于補體和凝血途徑、吞噬體等通路。對57例初診非耐藥肺結(jié)核病、53例抗結(jié)核治療2個月樣本、59例治愈樣本和60例健康對照組進(jìn)行ELISA和熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)，ALB、ARHGDIB、FCN2、miR-92a-3p、miR-125a-5p和miR-148b-3p可以作為非耐藥肺結(jié)核病的潛在診斷標(biāo)志物，并且由他們組成的非耐藥肺結(jié)

5、核病診斷模型正確率為94.37％;療效評價模型的正確率為85.33％。
　　結(jié)論:(1)建立了iTRAQ-2D LC-MS/MS蛋白組學(xué)檢測聯(lián)合Solexa轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序-整合分析-ELISA、SYBR green熒光定量PCR驗證的肺結(jié)核病血清標(biāo)志物檢測平臺;(2)篩選并驗證獲得非耐藥肺結(jié)核病的標(biāo)志物:ALB、ARHGDIB、FCN2、miR-92a-3p、miR-125a-5p和miR-148b-3p;(3)建立了靈敏度為94.

6、12％，特異性為94.59％的非耐藥肺結(jié)核病Logistic回歸診斷模型;同時，建立了靈敏度為79.41％，特異性為90.24％的療效評價模型。本課題的研究結(jié)果，為非耐藥肺結(jié)核病早期診斷和療效評價，提供了實驗室依據(jù)。
　　第二部分 耐多藥肺結(jié)核病生物學(xué)標(biāo)志物的篩選與鑒定
　　肺結(jié)核病(Pulmonary Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb感染肺部引起

7、的慢性傳染性疾病。根據(jù)感染的Mtb的耐藥性，肺結(jié)核病可分為非耐藥肺結(jié)核病(drug-sensitive tuberculosis，DS-TB)和耐藥肺結(jié)核病。對異煙肼、利福平兩種一線藥物均耐藥的稱為耐多藥肺結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)。臨床普遍應(yīng)用的耐多藥肺結(jié)核病的診斷方法存在耗時長、敏感性低等缺陷。為此，迫切需要建立一種快速、敏感、高效的診斷耐多藥肺結(jié)核病的新方法。然而，目前

8、尚無耐多藥肺結(jié)核病的生物學(xué)標(biāo)志物。
　　方法:本研究收集血清323例，其中150例健康對照、131例非耐藥肺結(jié)核病患者、42例耐多藥肺結(jié)核病患者。我們通過iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa測序技術(shù)篩選了耐多藥肺結(jié)核病、非耐藥肺結(jié)核病患者和健康對照組各10例（包括生物學(xué)重復(fù)）血清蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異。進(jìn)一步應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和熒光定

9、量PCR大樣本驗證選取的差異蛋白質(zhì)和miRNAs。通過ROC曲線分析和決策樹模型，建立耐多藥肺結(jié)核病的潛在診斷模型。
　　結(jié)果:我們通過iTRAQ-2D LC-MS/MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了50個在耐多藥肺結(jié)核病患者中和非耐藥肺結(jié)核病、健康對照均存在顯著差異的蛋白質(zhì)。通過Solexa測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)差異miRNAs43個。進(jìn)一步整合分析發(fā)現(xiàn)，11個差異蛋白質(zhì)和14個差異miRNAs間可形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且該網(wǎng)絡(luò)成分大多參與補體和凝血途徑。我們通過

10、靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)有調(diào)控關(guān)系的3對miRNAs-蛋白質(zhì):miR-4433b-5p-CD44、miR-424-5p-F11和miR-199b-5p-KNG1，驗證結(jié)果表明以上6個小分子在耐多藥肺結(jié)核病組較非耐藥肺結(jié)核病組和健康對照組存在顯著差異（P＜0.05），且miR-199b-5p和KNG1間存在負(fù)相關(guān)。由這些小分子組成的耐多藥肺結(jié)核病決策樹診斷模型的敏感度100.00％，特異度88.33％;十折交叉驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型正確率為83.33％。

11、
　　結(jié)論:(1)應(yīng)用iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa測序技術(shù)篩選了耐多藥肺結(jié)核病的差異蛋白質(zhì)和差異miRNAs。發(fā)現(xiàn)其中11個差異蛋白質(zhì)和14個差異miRNAs間可形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò);(2)通過ELISA和SYBR green qRT-PCR驗證獲得了耐多藥肺結(jié)核病潛在診斷標(biāo)志物:CD44、F11、KNG1、miR-4433b-5p、miR-424-5p和miR-199b-5p;(3)建立了敏感度100.00％，特異度

12、88.33％的決策樹模型，為耐多藥肺結(jié)核病臨床早期診斷，提供了新的資料。
　　第三部分 CTLA4基因單核苷酸多態(tài)性與肺結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)研究
　　根據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查報告，盡管世界上有三分之一的人感染過結(jié)核分枝桿菌，但只有5-15％的人會發(fā)病，提示個體差異在肺結(jié)核病的易感中起了極大的作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)與肺結(jié)核病易感性存在相關(guān)。結(jié)核分

13、枝桿菌感染可導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)激活。細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associatedantigen4，CTLA4)是細(xì)胞免疫中關(guān)鍵的免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CTLA4+49位點(rs231775)、+6230位點(rs3087243)、11430位點(rs11571319)與一些自身免疫疾病易感性相關(guān)，且能影響CTLA4抑制細(xì)胞免疫活性。
　　方法:本實驗應(yīng)用PCR擴(kuò)增和DNA測序技術(shù)，采

14、用病例-對照方法，檢測了中國漢族人群274例肺結(jié)核病患者和266例健康對照血樣CTLA4+49位點(rs231775)、+6230位點(rs3087243)和11430位點(rs11571319)的基因型及等位基因頻率。并應(yīng)用Haploview4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析及單體型分析。進(jìn)一步根據(jù)美國結(jié)核病協(xié)會(National Tuberculosis Association，NTA)分類法對肺結(jié)核病患者進(jìn)行輕、中、重度分組;根據(jù)CT/

15、X線胸片對肺結(jié)核病患者進(jìn)行單/雙肺損害分組，揭示CTLA4 SNPs與肺結(jié)核病易感及病理損傷的相關(guān)性。
　　結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)CTLA4基因3個SNPs位點的等位基因頻率在肺結(jié)核病組和健康對照組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。但是，在肺結(jié)核病患者中，CTLA4+49 AG基因型頻率(38.42％)顯著低于健康對照組(49.77％)，并與肺結(jié)核病易感性呈負(fù)相關(guān)（P=0.038，95％CI0.436-0.978）。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，

16、發(fā)現(xiàn)CTLA4+49位點和+6230位點之間有強(qiáng)連鎖不平衡現(xiàn)象(D＞0.075，r2＞0.3)。單體型分析發(fā)現(xiàn)，健康對照組+49A/+6230G/11430G單體型出現(xiàn)頻率(0.069)明顯高于肺結(jié)核病組（0.014，P＜0.0001，95％CI0.072-0.468）。進(jìn)行NTA分類后，等位基因頻率、基因型頻率和單體型均無顯著差異（P＞0.05）;而進(jìn)行單/雙肺損害分析后，發(fā)現(xiàn)+49G/+6230G/11430A單體型與雙肺損傷密切相

17、關(guān)（P=0.018）。
　　結(jié)論:(1)采用病例-對照方法及統(tǒng)計學(xué)分析，首次對CTLA4基因+49、+6230、11430位點與肺結(jié)核病的易感性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究;(2)CTLA4的+6230和11430位點SNPs與中國漢族肺結(jié)核病易感性不相關(guān)，而+49AG基因型可降低個體感染肺結(jié)核病的風(fēng)險，是保護(hù)性位點;(3)+49A/+6230G/11430G單體型為健康對照的保護(hù)性單體型，+49G/+6230G/11430A單體型與雙肺損傷密