安絲菌素后修飾及安莎類抗生素聚酮鏈的釋放.pdf

1、安絲菌素(Ansamitocins)是19元大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物,屬于Ⅰ型聚酮類安莎霉素(ansamycins),對多種腫瘤細胞株具有顯著的抑制活性。該化合物生物合成機制和復雜的后修飾反應已經(jīng)得到了深入的研究。本文主要對安絲菌素生物合成后修飾中的D-甲基轉(zhuǎn)移酶(Asm7)以及安莎類抗生素聚酮鏈釋放與環(huán)化機制兩個方面開展了相應的工作。
　　 第一部分的研究內(nèi)容主要是關于O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Asm7)后修飾順序。通過基因缺失與回補實驗確定

2、了基因asm7編碼的蛋白是負責安絲菌素C-20位羥基的甲基化?；騛sm7突變株在液體和固體YMG培養(yǎng)基中分別產(chǎn)生了20-氧,氮.二去甲基安絲菌素P-3和20-氧—去甲基安絲菌素P-3,并通過核磁共振進行了相關化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。生物信息學分析顯示Asm7屬于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴的Ⅱ型甲基轉(zhuǎn)移酶家族。利用大腸桿菌異源表達的Asm7天然活性蛋白以二聚體的形式存在,單體的分子量大小為41 kDa。通過相應突變株的大量發(fā)酵得到了需要的

3、底物,并以SAM和19-氯代原安絲菌素為底物,確定了Asm7的最適反應溫度為35℃,最適pH為8.0,最佳金屬離子為5 mM的MgCl2。另外,通過比較Asm7對原安絲菌素、19-氯代原安絲菌素和20-氧,氮—二去甲基—脫氧美登木醇三種底物的體外酶促反應動力學差異的分析,確定了O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Asm7)在安絲菌素后修飾中的確切催化順序。
　　 第二部分是關于安莎類抗生素聚酮鏈釋放與環(huán)化。從生物合成角度分析,安莎類抗生素由Ⅰ型聚酮

4、合酶催化形成。在典型的Ⅰ型聚酮合酶的C末端存在一個屬于α/β水解酶超家族的硫酯酶TE結(jié)構(gòu)域,負責催化分子內(nèi)或分子外的親核反應實現(xiàn)聚酮鏈的釋放。前期研究發(fā)現(xiàn),安莎類抗生素生物合成基因簇中負責聚酮鏈釋放的蛋白是由芳胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的酰胺合酶基因編碼,與硫酯酶有較大的差異,代表著一類新穎的聚酮鏈釋放和成環(huán)機制。本論文采用安絲菌素、萘霉素、利福霉素、格爾登素等產(chǎn)生菌為研究材料開展了相應的工作。首先,利用體內(nèi)基因突變與互補實驗驗證了酰胺合酶基

5、因?qū)τ诎采惢衔锖铣傻谋匾?同時也發(fā)現(xiàn)了安莎類抗生素之間的酰胺合酶基因沒有功能互補性;其次,通過末端ACP的置換實驗以及細菌雙雜交實驗考查了末端ACP與酰胺合酶之間的關系;最后,為了進一步的明確酰胺合酶的催化機制,利用大腸桿菌作為表達宿主對其的進行了異源表達。接下來將會利用化學合成底物進行體外酶催化分析、定點突變確定其關鍵氨基酸特征,以及考察酰胺合酶和聚酮模塊末端酰基載體蛋白之間的關系等方面工作,一來闡明酰胺合酶對安莎類抗生素釋放和