Rac、Cdc42信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的FRET單分子探針的特征分析.pdf

1、Rho鳥(niǎo)苷三磷酸酶(Rho GTPases)，包括Rac和Cdc42，是一類(lèi)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域中研究較多的蛋白分子，其主要調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞遷移、細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)等一系列細(xì)胞過(guò)程。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，Rho GTPases通常作為分子開(kāi)關(guān)將上游信號(hào)刺激傳遞給下游效應(yīng)分子或靶蛋白，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。鳥(niǎo)苷酸交換因子、Rho GTPases活化蛋白和GDP解離抑制因子三類(lèi)蛋白分子調(diào)節(jié)Rho GTPases的有無(wú)活性狀態(tài)。 本文

2、利用本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)FRET原理構(gòu)建的包含紅色熒光蛋白DsRed1全基因，信號(hào)分子Rac1或Cdc42全基因，效應(yīng)分子Pak1或N-WASP的GTP酶聯(lián)結(jié)區(qū)域，青色熒光蛋白CFP全基因的幾種單分子探針轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞。轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞后，以胰島素、緩激肽為誘導(dǎo)劑，分別激活Rac1、Cdc42信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。離體熒光光譜檢測(cè)表明，在轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生了FRET現(xiàn)象。在未誘導(dǎo)激活前，不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的FRET效率已達(dá)相對(duì)較高水平。誘導(dǎo)激活5min后，均

3、達(dá)到最高值，但增加幅度有顯著差異。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)RET效率下降，但下降速率在不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間有較大差異。蛋白激活試驗(yàn)證實(shí)，誘導(dǎo)激活的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，Rac1、Cdc42均處于激活狀態(tài)，其在不同誘導(dǎo)時(shí)間的相對(duì)激活程度與FRET效率表現(xiàn)一致。誘導(dǎo)激活的Rac1、Cdc42信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別導(dǎo)致轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞中出現(xiàn)片狀偽足和絲狀偽足。這表明采用這些FRET單分子探針，可直接監(jiān)測(cè)細(xì)胞中激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的時(shí)空變化及其產(chǎn)生的相應(yīng)的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。