定量成像誘導(dǎo)激活的Rac1、Cdc42信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.pdf

1、敷 溯 命 失 摩碩一 士 學(xué) 位 論 文定 量 成 像 誘 導(dǎo) 激 活 的Rac l、 Cdc42信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 通 路學(xué) 科 專 業(yè)學(xué) 位 類 型研 究 生 姓 名導(dǎo) 師姓 名 、職稱論 文 編 號遺 傳 學(xué)口 科 學(xué)學(xué)位 口專業(yè) 學(xué)位任 道 全郭 向 榮 教 授湖 南 師 范 大 學(xué) 學(xué) 位 評 定 委 員 會 辦 公 室二 零 零 九 年 五 月摘可石 弓丈Rho 鳥營 三磷 酸 酶 (RhoGTPaseS) ，包 括 RaC

2、和 Cde42 ，是一 類 在 細(xì)胞信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo)領(lǐng) 域 中研 究較 多 的蛋 白分子 ， 其 主 要 調(diào) 節(jié) 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 錄 、 細(xì) 胞 遷 移 、細(xì) 胞 形 態(tài) 和 基 因 表 達(dá) 等 一 系 列 細(xì) 胞 過 程 。在 細(xì) 胞 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 過 程 中 ，RhoGTPa seS 通 常 作 為 分 子 開 關(guān) 將 上 游 信 號 刺 激 傳 遞 給 下 游 效 應(yīng) 分 子 或 靶 蛋白，產(chǎn) 生 細(xì) 胞 內(nèi)或 者 細(xì) 胞 間 的生物

3、 學(xué) 效 應(yīng) 。鳥普 酸 交 換 因子 (GEF) 、RhoGT Pa seS 活 化 蛋 白和 GDP 解 離抑 制 因子三類 蛋 白分 子 調(diào)節(jié) RhoGTPas eS 的有無 活 性 狀 態(tài) 。本 文 基 于 熒 光 共 振 能量 轉(zhuǎn) 移 (FRET) 原 理 構(gòu) 建 了單 分 子 探 針 ， 包 含 紅 色熒光 蛋 白 DSRedl 全 基 因 、 信 號 分 子 Rac l 或 CdC42 全 基 因 、 效 應(yīng) 分 子 Pa

4、k l或 N一 wA SP 的 GTP 酶 聯(lián) 結(jié) 區(qū)域 、加 強青 色 熒 光 蛋 白 (eCFP)或 加 強 綠 色 熒 光蛋 白 (eGFP) 的全 基 因 。把 凡種 單 核 營 酸 分 子 探 針 分 別 轉(zhuǎn) 染 幾 種 動 物 細(xì) 胞 ，然 后 以胰 島素 (Ins ul in) 、緩激 膚 (Bra dyk ini n) 為 誘 導(dǎo) 劑 ，分 別 誘 導(dǎo)激 活Rac l、Cdc42 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo)通 路 ，在 不 同時 間

5、段 對 活 細(xì) 胞 的熒 光 強度 檢 測 和 成像 。定 量 成 像 誘 導(dǎo)激 活 的 Rac l、Cdc42 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo)通 路 ，在 轉(zhuǎn) 染 的動 物 細(xì) 胞中產(chǎn) 生 了 FRET 現(xiàn) 象 。 未 誘 導(dǎo)激 活前 ， 不 同信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 通 路 有 一 定 水 平 的 FRET效 率 ，誘 導(dǎo)激 活 后 ， 其 FRET 效 率 均 大 幅度 地 、快 速 地 增 加 ，誘 導(dǎo) 激 活 5一8m in 后 ，均 達(dá) 到 最 大

6、 值 ，但 不 同信 號轉(zhuǎn) 導(dǎo)通 路 增 加 幅度 有 顯 著 差 異 。隨著 誘 導(dǎo) 時 間 的推 移 ，F(xiàn)RET 效 率 均 逐 漸 下 降 ，下 降 的速 率 比誘 導(dǎo) 激 活 增 加進(jìn) 的速 率 慢 ，且 下 降速 率 在 不 同信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 通 路 間有 較 大 差 異 。超 過 30 m in后 ，F(xiàn)RE T 效 率 與 最初 的水 平相 似 。蛋 白激 活 試 驗 證 實 ，誘 導(dǎo) 激 活 的轉(zhuǎn) 染細(xì) 胞 中 ，Rac