蠟梅結(jié)瘤素基因CpNOD的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、根瘤是豆科植物與土壤中的根瘤菌相互作用形成的一個(gè)獨(dú)特器官。根瘤中的根瘤菌從宿主植物中吸收能量供自生生長發(fā)育,并將土壤中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨供宿主植物吸收,形成一個(gè)根瘤菌-植物共生固氮體系。許多基因參與共生固氮作用,在根瘤形成與維持過程中起著重要作用,這些特異地存在于植物根瘤細(xì)胞中并參與共生固氮作用的植物基因產(chǎn)物被統(tǒng)稱為結(jié)瘤素(nodulin)。結(jié)瘤素存在于豆科植物以及一些非豆科植物中。
　　 結(jié)瘤素根據(jù)其功能分為早期結(jié)瘤素和晚期結(jié)瘤素

2、。早期結(jié)瘤素(earlynodulin)是指在根瘤形成初期誘導(dǎo)表達(dá)的一種結(jié)瘤素。早期結(jié)瘤素產(chǎn)物主要參與根瘤菌與根毛的相互作用、根瘤菌與植物之間的信號(hào)傳導(dǎo)、根瘤菌的侵染以及根瘤的初期形成。ENOD93就是一種早期結(jié)瘤素,目前ENOD93家族雖然在一些植物中被發(fā)現(xiàn),但是它在根瘤形成過程中的功能以及在非豆科植物中的作用目前還不是十分明確。
　　 本論文從蠟梅花cDNA文庫中得到一個(gè)CpNOD基因片段,并通過克隆得到完整片段,對(duì)于CpN

3、OD基因本文主要做了如下工作:
　　 1.蠟梅CpNOD基因的克隆和生物信息學(xué)分析
　　 通過隨機(jī)挑選蠟梅cDNA文庫測序.獲得了大小為300bp的EST序列,然后通過hiTAIL-PCR,RACE克隆出cDNA全長為611bp,其中含有333bp的開放閱讀框,編碼蛋白長110個(gè)氨基酸,其中堿性氨基酸17個(gè)。酸性氨基酸9個(gè),疏水氨基酸49個(gè)。極性氨基酸26個(gè),G+C含量47.45%,等電點(diǎn)(pI)9.87.屬于堿性蛋白通

4、過PredictProtein進(jìn)行在線分析,CpNOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α0螺旋(alpha-helix)69.009,f-折疊beta-sheet)占6.36%,而隨機(jī)卷曲(coil)則占37.3%。CpNOD蛋白不具有信號(hào)肽,有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,可能為跨膜蛋白。BLASTX比對(duì)結(jié)果顯示它與ENOD93家族具有很高的同源性.和步推定所獲得的cDNA為早期結(jié)瘤素基因,命名為CpNOD(基因登記號(hào):JQ622290)。
　　 2.CpN

5、OD基因在蠟梅器官中的表達(dá)分析
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法研究CpNOD基因在蠟梅植株中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示CpNOD在蠟梅幼苗期的根和花中瓣、內(nèi)瓣中大量表達(dá),在中瓣中尤其具有表達(dá)優(yōu)勢;CpNOD在蠟梅花不同花期中的表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果顯示,基因表達(dá)量與蠟梅花器官成熟程度成正相關(guān),隨著花器的成熟,CpNOD相對(duì)表達(dá)量增加,由此推測,CqNOD在蠟梅花的開花過程中可能有重要作用。
　　 3.CpNOD植物表達(dá)載體的構(gòu)建