Notch信號通路介導膿毒癥腦病的作用及機制研究.pdf

1、膿毒癥腦病又稱膿毒癥相關性腦病(Sepsis-associated encephalopathy，SAE)是膿毒癥引起的彌漫性腦功能障礙，其發(fā)病率為8％-70％。臨床研究發(fā)現，SAE是ICU中最常見的腦病之一，并發(fā)SAE可導致膿毒癥患者的死亡率明顯增高。SAE病理生理機制較復雜，其發(fā)病機制尚不明確，但是大量的研究結果表明神經元凋亡是SAE發(fā)生及發(fā)展過程的重要表現之一。研究證實，在膿毒癥大鼠模型中，SAE可導致大鼠長期的記憶損傷。其中，與

2、空間記憶密切相關的海馬等腦區(qū)的損傷程度尤為明顯。
　　本研究以Notch信號通路為主要研究對象，探討SAE發(fā)病機制。Notch信號通路是調控神經元凋亡的關鍵信號通路之一。最新研究表明，γ-分泌酶復合體和Notch1參與了一些神經變性疾病的發(fā)病過程，如阿爾茨海默病、缺血性腦卒中等。同時，Notch信號通路特異性抑制劑DAPT可有效抑制凋亡和炎癥反應介導的腦缺血性損傷，其作用機制與Notch信號通路在PARP-1激活凋亡過程中起到調控

3、作用有關。新近研究發(fā)現，PARP-1激活后通過自身分裂和核內凋亡相關因子，活化caspase通路，從而導致神經元的凋亡。
　　本研究以盲腸結扎穿刺法(CLP)建立大鼠的膿毒癥模型，集中開展了Notch信號通路在SAE中的作用及其機制研究。研究表明，CLP后24小時，Notch受體細胞內區(qū)域(NICD)表達顯著增加，大鼠海馬組織炎癥反應、神經元凋亡、神經元死亡等也明顯增加。DAPT能明顯減少海馬組織神經元凋亡和死亡，以及TNF-α、

4、IL-1b、IL-6、PARP-1和Caspase-1的表達。同時，CLP引起NF-κB轉核作用也可被DAPT明顯抑制。
　　綜上所述，Notch信號通路參與了膿毒癥導致的腦損傷，其作用機制與調控NF-κB轉核有關。研究結果可為SAE的治療提供新的策略和藥物靶標。
　　第一部分 Notch信號通路在膿毒癥腦病中的作用
　　目的:膿毒癥相關性腦病(SAE)病理生理機制尚不明確，缺乏客觀的診斷指標及有效的治療和預防手段。研

5、究發(fā)現γ-分泌酶復合體和Notch1參與了一些神經變性疾病的發(fā)病過程，γ-分泌酶抑制劑DAPT能抑制凋亡和炎癥反應介導的腦缺血性損傷。本部分選用盲腸結扎穿刺法(CLP)建立膿毒癥模型，觀察Notch信號通路在膿毒癥腦病中的作用及DAPT對膿毒癥腦病的保護作用。
　　方法:取SD大鼠，建立CLP模型，戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部剃毛并用碘伏消毒，鋪巾，沿腹中線剪開2cm腹部切口，暴露盲腸，在回盲瓣遠端結扎盲腸，然后用

6、18號針刺穿刺盲腸2次，輕輕擠壓盲腸，使少量的腸內容物滲出，然后將盲腸返回到腹腔，關閉腹腔。假手術組(sham)大鼠予剖腹，并將盲腸外置1分鐘，不予盲腸穿刺或結扎，然后將盲腸回納至腹腔并關腹。每只手術操作的大鼠術后每6小時給予皮下注射生理鹽水（3ml/100g）及頭孢曲松（30mg/kg）。實驗于麻醉后直視下行股動脈切開置入24G輸液管以測定血壓、心率。記錄術前、術后6h、12h和24h血壓、心率和肛溫，并在以上時間點經股動脈采血1ml

7、測血乳酸水平（每個時間點，n=3）。59只大鼠隨機分為四組:(a)假手術+生理鹽水組(10ml/kg);(b)假手術+DAPT組(10μmol/kg);(c)CLP+生理鹽水組(10ml/kg);(d)CLP+DAPT組（10μmol/kg）。每組分為2個亞組，第一亞組，24小時處死大鼠，斷頭取血，分離海馬組織，-80℃保存，行NICD的Western-Blot蛋白檢測。第二亞組，術后每6小時予皮下注射生理鹽水(3ml/100g)及頭孢

8、曲松(30mg/kg)，并允許自由進食及飲水。術后第7天存活大鼠檢測行為學改變（新物體識別實驗）。
　　結果:CLP組大鼠出現蜷縮少動、豎毛，個別大鼠出現偏癱、癲癇發(fā)作表現;并出現平均動脈壓明顯下降，心率明顯升高，血乳酸水平增高;體重明顯下降;第3天為56.3％，第4-7天為37.5％; CLP組大鼠24h神經反射評分明顯下降，并在第4天、第7天已逐漸恢復;新物體認知試驗提示CLP大鼠學習記憶功能受損。在CLP后24h，NICD表

9、達顯著增加。γ-分泌酶抑制劑DAPT能降低CLP后NICD的表達，緩解認知功能損傷。
　　結論: CLP組大鼠完全模擬了膿毒癥典型臨床表現，神經反射評分及行為學檢查提示大鼠膿毒癥相關性腦病(SAE)模型制作成功;首次發(fā)現在CLP后24h，NICD表達顯著增加，說明Notch信號通路可能參與了膿毒癥導致的腦損傷;同時應用DAPT抑制Notch信號通路對膿毒癥大鼠的記憶損傷有神經保護作用。
　　第二部分 Notch信號通路參與膿

10、毒癥腦病的機制研究
　　目的:在本實驗研究中，我們通過構建大鼠CLP膿毒癥模型，主要探討Notch信號通路參與膿毒癥腦病的可能發(fā)病機制，以及γ-分泌酶抑制劑通過阻斷Notch1信號通路對膿毒癥腦病大鼠的干預作用。
　　方法:隨機將59只SD大鼠分為4組，分別為假手術組(Sham)、假手術+DAPT組(Sham+DAPT)、CLP組(CLP)、CLP+DAPT組，在CLP或假手術后24h，將大鼠處死，取出海馬組織用于Weste

11、n blot法檢測PARP-1、Caspase-1; ELISA法檢測TNF-α、IL-1b、IL-6水平。TUNEL法觀察神經元凋亡，HE染色法觀察神經元死亡。
　　結果:我們研究表明在實驗動物中，比較于假手術組和假手術+DAPT組，在CLP組TNF-α、IL-1b、IL-6水平顯著增高，盡管在CLP+DAPT組增高受到抑制。通過HE染色和TUNEL染色法檢測，評估海馬組織神經細胞死亡和凋亡。在假手術組和假手術+DAPT組中幾乎

12、不能找到HE陽性的細胞。在CLP手術后，海馬組織CA1區(qū)域神經細胞死亡明顯增加。然而，與CLP組相比，HE染色陽性細胞在CLP+DAPT組明顯減少。此外，TUNEL法檢測神經細胞凋亡情況，在CLP組中TUNEL陽性細胞明顯增加，但是在假手術組幾乎不能檢測到TUNEL陽性細胞。而神經細胞凋亡數目在CLP+DAPT組明顯多于假手術組+DAPT組，與CLP組比較，前兩組凋亡數目明顯減少。
　　在膿毒癥大鼠中，海馬組織炎癥反應、神經元凋亡

13、、神經元死亡明顯增加。DAPT能明顯減少海馬組織神經元凋亡和死亡，及其TNF-α、IL-1b、IL-6、PARP-1和Caspase-1的表達。
　　結論:證實了Notch信號通路通過激活PARP-1降解，導致caspase依賴性神經元凋亡，γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制海馬神經元PARP-1降解，抑制caspase依賴性神經元凋亡。DAPT通過抑制CLP膿毒癥大鼠海馬組織神經元凋亡和炎癥反應改善膿毒癥腦病。
　　第三部分 N

14、otch信號通路調控膿毒癥腦病的分子機制研究:調控NF-κB激活
　　目的:NF-κB是在核內參與炎癥反應的關鍵轉錄因子，亦廣泛存在于神經系統(tǒng)的細胞中，調控神經細胞炎癥反應及凋亡。研究顯示，NF-κB信號途徑在膿毒癥神經系統(tǒng)炎癥中也扮有重要角色。本實驗部分采用CLP模型，研究膿毒癥對神經細胞NF-κB信號通路的影響，并通過Notch特異性抑制劑DAPT干預，觀察其對NF-κB信號通路的影響，由此深入研究Notch對膿毒癥腦病NF-

15、κB信號通路的調控作用。
　　方法:取SD大鼠，隨機分為四組(n=6)，分別為假手術組（Sham）、假手術+ DAPT組(Sham+DAPT)、CLP組(CLP)、CLP+DAPT組。手術操作前30分鐘腹腔注射DAPT（10μmol/kg）或生理鹽水(10mL/kg)。術后每6小時皮下注射生理鹽水(3ml/100g)及頭孢曲松(30mg/kg)復蘇，24小時處死大鼠，取大鼠海馬組織，液氮保存待測。用western blot和EMU

16、SA分組檢測NF-κ蛋白表達水平。
　　結果:在Sham組動物中，核因子NF-κB在胞漿中表達，CLP使得NF-κB胞漿向胞核內轉移。與Sham組相比，CLP組胞核內NF-κB蛋白含量明顯升高，以p65最為顯著。與Sham及Sham+DAPT組相比，CLP組胞核內NF-κB蛋白含量明顯升高，但DAPT處理降低胞核內p65、 p50及RelB蛋白表達水平。與Sham組相比，CLP組磷酸化IKK-β表達明顯升高，但DAPT處理可抑制C

17、LP時磷酸化IKK-β表達。同樣，DAPT處理可抑制p65磷酸化，其可能與IKK-β活性降低有關，相應的必然會導致p65 DNA結合活性降低。
　　結論:本研究中我們證實CLP導致的膿毒癥引起NF-κB由海馬神經細胞胞漿向胞核內遷移，應用Notch信號通路特異性抑制劑DAPT抑制Notch靶基因表達，抑制NF-κB向胞核內遷移及其DNA結合活性。結合前文，NF-κB依賴的轉錄激活引起膿毒癥海馬神經細胞炎癥反應及細胞凋亡，可能是導致