急性白血病骨髓基質(zhì)GJIC變化及其機制的研究.pdf

1、造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是造血干/祖細胞定殖、分化、發(fā)育和成熟的場所，造血基質(zhì)細胞是造血微環(huán)境的主要成分。造血基質(zhì)細胞通過與造血實質(zhì)細胞密切接觸、分泌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和多種造血生長因子(hematopoietic growth factor，HGF)來調(diào)節(jié)造血細胞的自我更新、增殖和分化過程，以保證機體造血功能的正常

2、進行。關(guān)于造血功能損傷與修復(fù)的研究與應(yīng)用，既往多側(cè)重于造血實質(zhì)細胞，對構(gòu)成造血微環(huán)境重要成分的造血基質(zhì)細胞的研究尚需進一步深入。 間隙連接細胞間通訊(gap iunction intercellular communication，GJIC)是相鄰細胞之間信號傳遞的主要方式，GJIC的物質(zhì)基礎(chǔ)是相鄰細胞膜上連接子偶聯(lián)形成的通訊通道，由連接蛋白(Connexin，Cx)組成，在造血組織中主要是Cx413。近期國內(nèi)外研究表明， Cx

3、413介導(dǎo)的GJIC是骨髓基質(zhì)細胞調(diào)控造血的必要條件。急性白血病作為一種常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其骨髓基質(zhì)細胞上Cx43蛋白的表達以及GJIC功能和正常骨髓基質(zhì)細胞比較是否存在差異?GJIC功能的差異是否會影響基質(zhì)細胞的生物學特性及支持造血的能力?是否可以通過藥物等外源性介質(zhì)改變白血病骨髓基質(zhì)細胞Cx413的表達及GJIC的功能?目前尚未見相關(guān)研究發(fā)表。結(jié)合科室研究方向，本實驗對上述問題進行探討。相關(guān)實驗結(jié)果如下： 1．通過免疫

4、細胞化學、流式細胞術(shù)、激光共聚焦掃瞄顯微鏡及RT-PCR等方法在不同水平上檢測初發(fā)急性白血病、正常及化療后完全緩解的急性白血病骨髓基質(zhì)細胞上Cx43的表達。結(jié)果顯示：(1)免疫細胞化學法檢測急性白血病骨髓基質(zhì)細胞Cx43的表達陽性率為(47.2±2.04)％，較正常(86.4±6.23)％及化療后完全緩解急性白血病骨髓基質(zhì)細胞(61.2±8.24)％明顯減低(p<0.01)，正常及急性白血病化療前、后骨髓基質(zhì)細胞上Cx43蛋白的平均光密

5、度值分別為121.0±16.28、48.3±11.69及93.3±14.38，各組間差異有統(tǒng)計學意義(p值均<0.01)，并出現(xiàn)定位異常；(2)流式細胞術(shù)檢測急性白血病骨髓基質(zhì)細胞Cx4-3蛋白表達量為(38.75±23.95)％，與其它兩組((76.51±13.15)％和(71.98±7.5)％)間有非常顯著的統(tǒng)計學差異(p值均<0.01)；(3)使用激光共聚焦掃瞄顯微鏡對正常、急性白血病以及急性白血病化療后完全緩解骨髓基質(zhì)細胞上Cx

6、43的定量結(jié)果顯示，其象素密度分別為：(81.04±8.84)％、(34.10±17.91)％和(70.33±4.90)％。 初發(fā)急性白血病骨髓基質(zhì)細胞上的Cx43含量明顯低于正常及化療后完全緩解的骨髓基質(zhì)細胞(p<0.01)；(4)RT-PCR方法檢測三組實驗樣本的基質(zhì)細胞上Cx43的mRNA，初發(fā)急性白血病組的表達能力明顯低于正常及化療后完全緩解的骨髓基質(zhì)細胞(p<0.01)。通過染料傳輸實驗及熒光漂白恢復(fù)技術(shù)比較發(fā)現(xiàn)急性白

7、血病骨髓基質(zhì)GJIC功能明顯減弱。其中，染料傳輸實驗顯示，正常骨髓基質(zhì)細胞上的LY熒光通過間隙連接傳輸至10個細胞以上，初發(fā)的急性白血病骨髓基質(zhì)細胞的熒光彌散至較近的1～2列細胞，化療后完全緩解的骨髓基質(zhì)細胞的細胞間通訊功能較化療前明顯增強，LY熒光染色彌散4～5列細胞，白血病骨髓基質(zhì)細胞組與正常骨髓基質(zhì)細胞組相比較差異顯著(p<0.01)，白血病骨髓基質(zhì)細胞組與化療后CR的骨髓基質(zhì)細胞組相比較差異顯著(p<0.01)；熒光漂白恢復(fù)技術(shù)

8、顯示，正常及完全緩解的骨髓基質(zhì)細胞的最大恢復(fù)比例為(84.29±2.93)％和(78.94±2.46)％，平均熒光恢復(fù)速率分別為(19.20±1.39)％/min和(13.52±1.65)％/min，急性白血病骨髓基質(zhì)細胞的最大恢復(fù)比例為(38.30±2.95)％，平均熒光恢復(fù)速率為(5.58±1.00)％/min，與前兩組間有非常顯著性差異(p<0.01)。 2．應(yīng)用免疫細胞化學、流式細胞術(shù)、激光共聚焦掃瞄顯微鏡及RT-PCR

9、等方法檢測初發(fā)急性白血病骨髓基質(zhì)細胞在全反式維甲酸及兩性霉素B作用下Cx43表達的變化，并通過染料傳輸實驗及熒光漂白恢復(fù)技術(shù)比較其GJIC功能的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)免疫細胞化學法檢測ABMSCs-ATRA組Cx43表達的陽性率和平均光密度值分別為(54.5±5.66)％和84.3±8.80，明顯高于ABMSCs組(p值均<0.01)；ABMSCs-AB組Cx43表達的陽性率和平均光密度值分別為(45.3±3.26)％和45.8±4.1

10、5，和ABMSCs組沒有統(tǒng)計學差異(p>0.05)。(2)流式細胞術(shù)檢測ABMSCs-ATRA組Cx43蛋白的表達陽性率為(49.5±5.46)％，明顯高于其余兩組(p值均<0.01)；ABMSCs組(38.75±23.95)％和ABMSCs-AB組(35.9±4.06)％之間沒有統(tǒng)計學差異(p>0.05)。(3)激光共聚焦掃瞄顯微鏡檢測ABMSCs-ATRA組Cx43熒光的象素密度為(45.25±5.98)％，明顯高于其余兩組，存在非

11、常顯著性差異(p<0.01)；ABMSCs和ABMSCs-AB組Cx43熒光的象素密度分別為(34.10±17.91)％和(32.9±3.98)％，兩組數(shù)據(jù)之間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。(4)RT-PCR方法檢測三組基質(zhì)細胞Cx43的mRNA，其中ABMSCs-ATRA組的表達量明顯高于其它兩組(p<0.01)。(5)染料傳輸實驗顯示，ABMSCs-ATRA組上的LY可彌散至4～5個細胞，明顯高于ABMSCs組(p<0.01)，

12、ABMSCs-AB組未發(fā)生彌散，和ABMSCs組有非常顯著性差異(p<0.01)。(6)FRAP結(jié)果顯示，ABMSCs-ATRA組細胞的熒光最大恢復(fù)速率為(80.94±1.46)％，平均恢復(fù)速率為(15.03±1.27)％/min；和ABMSCs組間有非常顯著性差異(p<0.01)。ABMSCs-AB組基質(zhì)細胞上的熒光在淬滅后400秒內(nèi)無恢復(fù)。 3．觀察急性白血病骨髓基質(zhì)細胞在全反式維甲酸作用下引起的GJIC功能的改變及其導(dǎo)致的

13、生物學特點的變化。結(jié)果現(xiàn)示：全反式維甲酸所引起的GJIC功能上調(diào)可使急性白血病骨髓基質(zhì)細胞的(1)增殖減慢，增殖周期中S期細胞減少(29.5％→7.96％)，G<,0>/G<,1>期細胞比例增加(61.1％→77.2％)；(2)凋亡率增加(5.16±2.35％→9.78±4.88％)；(3)造血生長因子GM-CSF分泌減少(10280.0±950→9260.0±123)，SCF分泌減少(1490.7±188→1327.1±118)；(4

14、)增強細胞外鈣離子的內(nèi)流(17.92±3.31nmoL/L→76.54±9.6nmoL/L)(p<0.01)。 結(jié)論：在本實驗條件下，(1)急性白血病骨髓基質(zhì)細胞Cx43的含量較正常及化療后完全緩解急性白血病骨髓基質(zhì)細胞明顯減低且定位異常，其細胞間通訊功能明顯減弱；(2)全反式維甲酸可上調(diào)急性白血病骨髓基質(zhì)細胞Cx43的表達及GJIC的功能，兩性霉素B不影響急性白血病骨髓基質(zhì)細胞Cx43的表達但可以阻斷GJIC功能；(3)上調(diào)急