蛹蟲(chóng)草多糖降血糖的機(jī)理研究.pdf

1、1型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病(IDDM)是一種自身免疫性疾病，免疫系統(tǒng)選擇性攻擊胰腺胰島中的β細(xì)胞，導(dǎo)致β細(xì)胞的損傷以及胰島素的絕對(duì)缺乏。目前對(duì)于1型糖尿病的治療方法主要限于注射外源胰島素和飲食上的控制。由于中草藥降血糖的作用已早有記載，因此近年來(lái)，中草藥作為治療1型糖尿病的藥物或輔助藥物越來(lái)越受到重視。蛹蟲(chóng)草作為中草藥已有幾百年的歷史，它不但有與冬蟲(chóng)夏草相似的組分和生物活性，而且其無(wú)性型的成功分離也使得蛹蟲(chóng)草的大規(guī)模生產(chǎn)和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用

2、成為可能。本研究以蛹蟲(chóng)草多糖為材料，篩選出具有降血糖活性的多糖，并探討了多糖降血糖的免疫機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)以蛹蟲(chóng)草無(wú)性型菌種(ACCC50383)為出發(fā)菌株，通過(guò)一系列單因子實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了蛹蟲(chóng)草的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。然后分別自菌絲體、發(fā)酵液及人工培植的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中提取菌絲體胞內(nèi)多糖、胞外多糖和子實(shí)體多糖。經(jīng)過(guò)分離純化，從中得到組分單一的胞外多糖，其單糖組成為均一的甘露糖，具β構(gòu)型的吡喃糖環(huán)，分子量為34，938；胞內(nèi)多

3、糖含有至少2個(gè)不同分子量組分的多糖，其分子量主要集中在40萬(wàn)左右，單糖組成為單一的甘露糖；子實(shí)體多糖亦含有多個(gè)組分，其中以分子量為87萬(wàn)的多糖組分為主，另外還有幾個(gè)較小分子量的多糖組分，單糖組成為甘露糖與葡萄糖。 以多次低劑量鏈脲霉素(multiplelow-dosestreptozotocin，MLD-STZ)方法腹腔注射BALB/c雄性小鼠，成功誘導(dǎo)出糖尿病小鼠。對(duì)患病小鼠初期與后期免疫學(xué)分析顯示，在糖尿病發(fā)病初期，刺激后

4、胸腺細(xì)胞和脾臟細(xì)胞的IFNγ/IL-4比值均高于正常小鼠，表現(xiàn)出Th1極化傾向，隨著糖尿病病程的發(fā)展，胸腺細(xì)胞的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)向Th2極化，而脾臟細(xì)胞的IFNγ/IL-4也出現(xiàn)下降；與胸腺細(xì)胞或脾臟細(xì)胞的極化傾向不同，糖尿病小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TNFα/IL-6低于正常小鼠，表現(xiàn)出誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞向Th2極化的傾向；此外，MLD-STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNFα、IL-6的水平及吞噬活性都顯著低于正常小鼠的水平，腹腔巨噬

5、細(xì)胞胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量也顯著．下降，隨病程的發(fā)展巨噬細(xì)胞胞內(nèi)谷胱甘肽含量持續(xù)減少，同時(shí)小鼠血清中的谷胱甘肽水平也顯著降低。上述結(jié)果表明，MLD-STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠在不同患病時(shí)期有不同的Th極化傾向，不同的免疫細(xì)胞其Th極化也有差異；另外腹腔巨噬細(xì)胞出現(xiàn)明顯的功能缺陷，該缺陷可能與其胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)有關(guān)，而STZ造成機(jī)體的過(guò)氧化態(tài)可能與糖尿病的發(fā)病有關(guān)。 以MLD-STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠為疾病模型，腹腔注射濃度均為300

6、mg/kg子實(shí)體多糖、菌絲體多糖和胞外多糖，連續(xù)注射12天，篩選具有降血糖活性的多糖。結(jié)果表明，只有胞外多糖有明顯的降血糖活性。通過(guò)對(duì)胰島、脾臟及肝臟的組織染色觀察表明，該模型小鼠的胰島存在明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損壞，同時(shí)脾臟和肝臟等器官也表現(xiàn)出不同程度的異常，與人類1型糖尿病相似。胞外多糖治療能夠緩解胰島的炎癥反應(yīng)，并改善患病小鼠脾臟的炎癥狀態(tài)。 下面的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了多糖對(duì)Th1/Th2的影響。通過(guò)對(duì)各組小鼠胸腺細(xì)胞、脾

7、臟細(xì)胞體外刺激后IFNγ、IL-4蛋白水平的分析，脾臟、胰腺組織中mRNA水平的比較，以及血清中細(xì)胞因子的水平比較，結(jié)果表明除胰腺外，胸腺、脾臟及血清的細(xì)胞因子類型均呈現(xiàn)Th1漂移現(xiàn)象；糖尿病小鼠脾臟細(xì)胞發(fā)生Th1極化的原因與脾臟APC細(xì)胞刺激后TNF-α(IL-12)/IL-6的比值較低有關(guān)；多糖可以通過(guò)提高脾臟APC分泌的IL-6的水平，部分糾正患病小鼠脾臟細(xì)胞的Th1極化傾向，但多糖對(duì)胸腺的Th1極化傾向無(wú)作用；多糖能夠顯著降低患

8、病小鼠血清的Th1類細(xì)胞因子，顯示出多糖對(duì)機(jī)體具有良好的綜合治療效果。 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多糖在體外也能夠改變刺激后脾臟細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平，并因此而影響正常小鼠脾臟細(xì)胞的Th分化傾向，該調(diào)節(jié)作用可能與多糖顯著提高脾臟APC分泌的IL-6水平有關(guān)。該多糖在體外對(duì)脾臟細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用與在體內(nèi)結(jié)果相似，這為下一步研究多糖與脾臟APC的作用，提供了較為方便的體外研究方法。 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的研究表明，雖然糖尿病小鼠腹腔巨

9、噬細(xì)胞的數(shù)量較正常小鼠明顯增多，但單個(gè)細(xì)胞功能存在缺陷，表現(xiàn)為脂多糖刺激后出現(xiàn)細(xì)胞因子分泌水平減少、一氧化氮產(chǎn)生量降低以及吞噬活性下降；功能缺陷的原因可能與單個(gè)細(xì)胞胞內(nèi)的過(guò)氧化狀態(tài)有關(guān)；多糖體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)脾臟APC的調(diào)節(jié)作用相似，多糖能夠顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-6水平，并對(duì)其釋放NO量以及吞噬活性均有促進(jìn)作用。多糖在體外對(duì)STZ造成的胰島細(xì)胞損傷并沒(méi)有直接保護(hù)作用，這可能意味著多糖對(duì)糖尿病小鼠免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用是降血糖的主

10、要原因，而非結(jié)果。 綜上所述，本研究首次自蛹蟲(chóng)草中篩選出具有降血糖活性的胞外多糖，該多糖不但具有明顯的降血糖效果，而且具有易于生產(chǎn)、提取率高、純度高等特點(diǎn)，有利于下一步的規(guī)模化生產(chǎn)、提取，可為1型糖尿病的治療或輔助治療提供新的選擇藥物。該多糖能夠在體內(nèi)及體外調(diào)節(jié)脾臟細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌水平，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的Th2極化傾向，從而抑制MLD-STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠發(fā)病初期脾臟細(xì)胞的Th1致病性極化，該誘導(dǎo)作用可能與其顯著提高非特異性免