牙鲆變態(tài)過程中右眼移動的新模型及相關(guān)基因的篩選.pdf

1、在生物發(fā)育中的形態(tài)生成過程中，目前為止人們對左右軸建立和破壞的機制的理解仍然非常模糊。左右不對稱的生物可以成為研究左右對稱軸建立和破壞的一個很好的實驗材料。鰈形目魚類(俗稱比目魚類)的變態(tài)，使一只眼睛逐漸地移動至頭部的另一側(cè)，在外形上表現(xiàn)出明顯地左右不對稱。所以，研究鰈形目魚類眼睛移動的機制，對揭示左右對稱軸的是如何破壞的一個極好的研究切入口。 已有解釋鰈形目魚類眼睛移動現(xiàn)象的各種假說。Brewst認(rèn)為眼睛移動是額骨變形造成的腦

2、顱前部變形，促使眼睛移動，然后，通過眼睛移動的一側(cè)的側(cè)篩骨的快速擴大，進(jìn)一步推動眼睛向上移動。此假說得到了Wagman、Okada等的支持。此假說是建立在對骨骼發(fā)育進(jìn)行觀察的基礎(chǔ)上，可能由于技術(shù)上的原因，而忽視了眼睛周圍其他組織的作用。 牙鲆(Paralichthysolivaceus)是目前研究眼睛移動現(xiàn)象最為集中的鰈形目魚類，在變態(tài)后，其右側(cè)的眼睛逐漸移至頭部左側(cè)。這里我們利用整體TUNEL方法和整體BrdU的原位檢測技術(shù)，

3、對從孵化后13天到43天的仔魚的凋亡細(xì)胞和分裂細(xì)胞的整體分布進(jìn)行了調(diào)查，在眼睛移動之前的仔魚(17天)，發(fā)現(xiàn)僅僅在脊髓和脊髓鞘中檢測到細(xì)胞凋亡，而在其它部位沒有檢測到任何的細(xì)胞凋亡。在眼睛移動之后，在腦顱的一些骨骼、腦、眼睛、內(nèi)耳、冠狀幼鰭基部、尾鰭基部、下頜骨、鰓弓及肝臟中檢測到細(xì)胞凋亡，初步表明細(xì)胞凋亡雖然與眼睛最初的移動沒有直接的關(guān)系，但在牙鲆變態(tài)的其它事件中起作用。在眼睛移動之前的13天和17天仔魚的眼睛周圍，則檢測到細(xì)胞分裂，

4、并且發(fā)現(xiàn)右側(cè)眼睛下方組織中的細(xì)胞分裂信號，要強于左側(cè)相同的位置上的信號。在眼睛移動之后，發(fā)現(xiàn)在兩只眼睛之間繞過頭背部的區(qū)域出現(xiàn)了不均衡的分裂帶，分裂帶右側(cè)的信號要強于左側(cè)。隨眼睛進(jìn)一步向上移動，分裂帶兩端仍然維持在原來的位置，因此，右側(cè)眼睛由于向上移動，使其下方的分裂細(xì)胞的數(shù)量比左側(cè)眼睛下方的分裂細(xì)胞的數(shù)量要明顯多得多，促使眼睛進(jìn)一步向上移動。利用硫脲抑制右眼移動，發(fā)現(xiàn)，牙鲆的細(xì)胞分裂被完全抑制，而細(xì)胞凋亡則沒有影響，這更直接證明細(xì)胞分

5、裂是驅(qū)使牙鲆右眼開始移動的原動力。根據(jù)以上的結(jié)果，我們提出了一個新的解釋鰈形目魚類眼睛移動的模型。此模型認(rèn)為，鰈形目魚類眼睛移動的驅(qū)動力產(chǎn)生于在腦顱骨化之前；哪只眼睛移動，取決于左右眼睛下方組織的細(xì)胞分裂的數(shù)量，在眼睛移動之后，不均勻的細(xì)胞分裂帶促進(jìn)眼睛進(jìn)一步移動。此模型能很好地解釋鰈形目魚類眼睛位置多樣性的現(xiàn)象，與已被摒棄的Giard提出的假說也很類似。 關(guān)于眼睛移動的信號調(diào)控，已經(jīng)有不少的研究。Inui&Miwa首先發(fā)現(xiàn)甲狀

6、腺激素能促進(jìn)眼睛移動，但不能確定哪種甲狀腺激素受體參與其中。Hashimoto等已證明牙鲆右眼的移動的信號調(diào)控途徑不同于脊椎動物內(nèi)臟左右不對稱的信號途徑。因此，到目前為止，還沒有一個明確的分子與眼睛移動有關(guān)。我們利用抑制差減雜交技術(shù)，以眼睛移動之前的17天仔魚的頭部RNA為驅(qū)動RNA，建立了眼睛開始移動的23天仔魚頭部的抑制差減cDNA文庫，利用相對定量RTPCR技術(shù)初步篩選陽性克隆，利用整體原位雜交技術(shù)確定基因的時空表達(dá)模式，對于與右

7、眼移動相關(guān)的候選基因，利用錨定PCR技術(shù)從建立的全長cDNA文庫中克隆全長cDNA。從抑制差減cDNA文庫克隆到的Sfrs3基因，發(fā)現(xiàn)在眼睛移動之后的頭部表達(dá)水平明顯增加，相比胚胎階段，在變態(tài)G階段和H階段的Sfrs3基因表達(dá)水平分別增加了4倍和7倍。在右眼移動之前，Sfrs3基因的表達(dá)主要集中在身體的尾部，而很少在頭部表達(dá)，隨右眼進(jìn)一步移動，表達(dá)逐漸向頭部集中，在右眼移至接近頭背部時(G階段)，Sfrs3基因的表達(dá)大部分集中在頭部，而

8、在身體后部基本沒有表達(dá)。對頭部的橫截面的進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)在右眼移動的G階段，Sfrs3基因在右側(cè)側(cè)篩骨和右側(cè)的“thicknessskin”中表達(dá)，尤其是在“thicknessskin”的表達(dá)信號要明顯強于其周圍的組織，“thicknessskin”的位置位于我們新模型中G階段細(xì)胞分裂帶右眼的下方，同時，根據(jù)Okada的研究，“thicknessskin”是一個細(xì)胞快速分裂的組織，逐漸變?yōu)镻seudomesialbar骨骼，推動右眼進(jìn)一

9、步向上移動。牙鲆Sfrs3基因是一個含RNA識別模序(RRM)和一個絲氨酸／精氨酸豐富的區(qū)域，和人類Sfrs3基因具有很高的同源性，是一個典型的RNA剪輯輔助因子。另外，人Sfrs3基因已證明參與細(xì)胞分裂周期的調(diào)節(jié)，牙鲆SFRS3很可能在“thicknessskin”的細(xì)胞分裂中起作用。今后需要進(jìn)一步的研究，明確確定牙鲆SFRS3參與牙鲆右眼移動。 另外，我們也探討了GAPDH、βactin和18srRNA三種作為RTPCR常用