牙鲆變態(tài)過程中microRNA的表達(dá)及其功能分析.pdf

1、牙鲆在胚后發(fā)育過程中有一個(gè)劇烈的變態(tài)發(fā)育過程，其組織、器官以及形態(tài)等都發(fā)生了劇烈的變化，涉及了許多生物學(xué)變化過程。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小單鏈RNA分子，長度為18～25 nt，廣泛存在于從線蟲到果蠅以及人的多種組織器官中，對(duì)動(dòng)植物的生長、發(fā)育、疾病發(fā)生等生物學(xué)過程起著重要的調(diào)控功能。miRNA作為動(dòng)物發(fā)育中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子，其在牙鲆變態(tài)發(fā)育中的相關(guān)研究到目前還未見報(bào)道。本論文主要從miRNA對(duì)牙鲆變態(tài)發(fā)育

2、的影響出發(fā)，鑒定變態(tài)過程中表達(dá)的miRNA、篩選不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)差異的miRNA，并進(jìn)一步分析了牙鲆變態(tài)過程中miR-1、miR-133和miR-206的表達(dá)及其對(duì)變態(tài)發(fā)育可能的調(diào)控作用，為揭示牙鲆變態(tài)發(fā)育的機(jī)制提供新的研究依據(jù)。
　　首先，利用新一代測(cè)序技術(shù)(Solexa sequencing)分析了牙鲆變態(tài)過程中的小RNA表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析了不同長度的小RNA的分布，發(fā)現(xiàn)測(cè)序的小RNA長度主要分布在20-23 nt區(qū)域。通過對(duì)測(cè)序

3、的小RNA數(shù)據(jù)與miRBase13.0中的miRNA序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果鑒定了140個(gè)的成熟miRNA和57個(gè)的成熟miRNA*s，又利用PCR克隆得到了20個(gè)miRNA的前體序列并通過RNAfold軟件分析了它們的二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些miRNA的真實(shí)性，同時(shí)分析了這些miRNA前體的保守性。為了驗(yàn)證這些鑒定的miRNA，通過熒光定量PCR、Northern blot以及miRNA芯片技術(shù)對(duì)這197個(gè)牙鲆miRNA進(jìn)行了實(shí)

4、驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步確定了這些miRNA的真實(shí)性以及Solexa測(cè)序用于鑒定miRNA的可靠性。根據(jù)miRNA在動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育中的保守性分布，這197個(gè)牙鲆miRNA（歸屬84個(gè)miRNA家族）被分為5個(gè)類群，有些miRNA家族在所有動(dòng)物中都表達(dá)，有些只在脊椎動(dòng)物中表達(dá);有些miRNA在物種進(jìn)化過程中其非“種子”區(qū)的某些堿基發(fā)生了替換，這些堿基替換發(fā)生在特定的物種，是物種特異的，比如miR-21在魚類與哺乳類中存在一個(gè)堿基差異，miR-29a在

5、牙鲆與其它3種魚中存在一個(gè)堿基差異。牙鲆變態(tài)過程中miRNA的鑒定為進(jìn)一步研究牙鲆變態(tài)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的參考依據(jù)。
　　然后，為了進(jìn)一步對(duì)牙鲆miRNA進(jìn)行功能研究，利用miRNA芯片技術(shù)對(duì)兩個(gè)不同變態(tài)發(fā)育時(shí)期(17和29 dph，days post hatching)的miRNA進(jìn)行了差異表達(dá)分析，篩選得到了66個(gè)差異表達(dá)的miRNA。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些miRNA與牙鲆變態(tài)過程中的組織、器官以及形態(tài)學(xué)變化有著密切的關(guān)

6、系，比如miR-25是與色素變化相關(guān)的，miR-203是皮膚特異的，miR-1、miR-133和miR-206是肌肉發(fā)特異的，miR-126是心血管發(fā)育相關(guān)的。該研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步探討miRNA在牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中的功能提供了重要的依據(jù)。
　　根據(jù)甲狀腺激素能夠促進(jìn)牙鲆的變態(tài)發(fā)育以及miRNA芯片差異表達(dá)篩選結(jié)果，利用熒光定量PCR技術(shù)分析了miR-1、miR-13a和miR-206a在牙鲆變態(tài)發(fā)育中的表達(dá)情況，旨在進(jìn)一步探討這三個(gè)

7、miRNA在牙鲆變態(tài)發(fā)育中對(duì)肌肉發(fā)育的調(diào)控作用。首先檢測(cè)了這三個(gè)miRNA在牙鲆成體不同組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-1和miR-133a主要在心臟和肌肉中表達(dá)，miR-206a主要在肌肉中表達(dá)。接下來檢測(cè)了這三個(gè)miRNA在牙鲆正常、甲狀腺素促進(jìn)和硫脲抑制的變態(tài)發(fā)育過程中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在變態(tài)過程中甲狀腺素能顯著促進(jìn)miR-1和miR-206a的表達(dá)，在一定程度上抑制miR-133a的表達(dá)。為了進(jìn)一步去探討這三個(gè)miRNA的功能

8、，我們利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)程序RNAhybrid預(yù)測(cè)了它們的靶基因，結(jié)果得到了13個(gè)miR-1的候選靶基因，8個(gè)miR-133a的候選靶基因以及16個(gè)miR-206a的候選靶基因。已有研究顯示，在肌肉發(fā)育中，miR-1和miR-206促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化，miR-133抑制成肌細(xì)胞的分化而促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖。因此，我們推測(cè)，在牙鲆變態(tài)發(fā)育早期，甲狀腺素促進(jìn)了miR-1和miR-206a的表達(dá)，啟動(dòng)了成肌細(xì)胞的分化，促進(jìn)了牙鲆的幼體型肌

9、肉轉(zhuǎn)變?yōu)槌审w型肌肉，從而進(jìn)一步加速了牙鲆的變態(tài)過程，其詳細(xì)的分子調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
　　MyoD、Myf5和Myogenin是肌肉發(fā)育中起關(guān)鍵作用的肌肉調(diào)節(jié)因子，它們?cè)诩∪獍l(fā)育早期的成肌細(xì)胞的決定、分化以及增殖中發(fā)揮著重要的作用。并且已有研究顯示，MyoD、Myf5和Myogenin在肌肉發(fā)育相關(guān)的miR-1、miR-133和miR-206的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也扮演著重要的作用。因此，我們分析了這三個(gè)肌肉調(diào)節(jié)因子在牙鲆變態(tài)發(fā)

10、育過程中的表達(dá)情況，旨在探討它們?cè)谘丽易儜B(tài)發(fā)育中對(duì)肌肉發(fā)育的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，在牙鲆變態(tài)發(fā)育期間，MyoD高豐度表達(dá)，在變態(tài)早期，甲狀腺素顯著促進(jìn)它的表達(dá)，在變態(tài)后期硫脲抑制了它的表達(dá);Myf5的表達(dá)顯著低于MyoD的水平，但在整個(gè)變態(tài)期間，甲狀腺素對(duì)它的促進(jìn)作用最顯著，而在變態(tài)后期，其表達(dá)水平也明顯受到硫脲的抑制;Myogenin的表達(dá)最弱，在變態(tài)后期，甲狀腺素抑制了它的表達(dá)，而硫脲卻顯著地促進(jìn)它的表達(dá)。這說明MyoD、Myf5以及