牙鲆變態(tài)過程中microRNA的表達及其功能分析.pdf

1、牙鲆在胚后發(fā)育過程中有一個劇烈的變態(tài)發(fā)育過程，其組織、器官以及形態(tài)等都發(fā)生了劇烈的變化，涉及了許多生物學(xué)變化過程。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小單鏈RNA分子，長度為18～25 nt，廣泛存在于從線蟲到果蠅以及人的多種組織器官中，對動植物的生長、發(fā)育、疾病發(fā)生等生物學(xué)過程起著重要的調(diào)控功能。miRNA作為動物發(fā)育中一個關(guān)鍵的調(diào)控因子，其在牙鲆變態(tài)發(fā)育中的相關(guān)研究到目前還未見報道。本論文主要從miRNA對牙鲆變態(tài)發(fā)育

2、的影響出發(fā)，鑒定變態(tài)過程中表達的miRNA、篩選不同發(fā)育時期表達差異的miRNA，并進一步分析了牙鲆變態(tài)過程中miR-1、miR-133和miR-206的表達及其對變態(tài)發(fā)育可能的調(diào)控作用，為揭示牙鲆變態(tài)發(fā)育的機制提供新的研究依據(jù)。
　　首先，利用新一代測序技術(shù)(Solexa sequencing)分析了牙鲆變態(tài)過程中的小RNA表達，統(tǒng)計分析了不同長度的小RNA的分布，發(fā)現(xiàn)測序的小RNA長度主要分布在20-23 nt區(qū)域。通過對測序

3、的小RNA數(shù)據(jù)與miRBase13.0中的miRNA序列進行了比對分析，結(jié)果鑒定了140個的成熟miRNA和57個的成熟miRNA*s，又利用PCR克隆得到了20個miRNA的前體序列并通過RNAfold軟件分析了它們的二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)，進一步驗證了這些miRNA的真實性，同時分析了這些miRNA前體的保守性。為了驗證這些鑒定的miRNA，通過熒光定量PCR、Northern blot以及miRNA芯片技術(shù)對這197個牙鲆miRNA進行了實

4、驗驗證，進一步確定了這些miRNA的真實性以及Solexa測序用于鑒定miRNA的可靠性。根據(jù)miRNA在動物系統(tǒng)發(fā)育中的保守性分布，這197個牙鲆miRNA（歸屬84個miRNA家族）被分為5個類群，有些miRNA家族在所有動物中都表達，有些只在脊椎動物中表達;有些miRNA在物種進化過程中其非“種子”區(qū)的某些堿基發(fā)生了替換，這些堿基替換發(fā)生在特定的物種，是物種特異的，比如miR-21在魚類與哺乳類中存在一個堿基差異，miR-29a在

5、牙鲆與其它3種魚中存在一個堿基差異。牙鲆變態(tài)過程中miRNA的鑒定為進一步研究牙鲆變態(tài)發(fā)育的分子調(diào)控機制提供了新的參考依據(jù)。
　　然后，為了進一步對牙鲆miRNA進行功能研究，利用miRNA芯片技術(shù)對兩個不同變態(tài)發(fā)育時期(17和29 dph，days post hatching)的miRNA進行了差異表達分析，篩選得到了66個差異表達的miRNA。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些miRNA與牙鲆變態(tài)過程中的組織、器官以及形態(tài)學(xué)變化有著密切的關(guān)

6、系，比如miR-25是與色素變化相關(guān)的，miR-203是皮膚特異的，miR-1、miR-133和miR-206是肌肉發(fā)特異的，miR-126是心血管發(fā)育相關(guān)的。該研究結(jié)果對進一步探討miRNA在牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中的功能提供了重要的依據(jù)。
　　根據(jù)甲狀腺激素能夠促進牙鲆的變態(tài)發(fā)育以及miRNA芯片差異表達篩選結(jié)果，利用熒光定量PCR技術(shù)分析了miR-1、miR-13a和miR-206a在牙鲆變態(tài)發(fā)育中的表達情況，旨在進一步探討這三個

7、miRNA在牙鲆變態(tài)發(fā)育中對肌肉發(fā)育的調(diào)控作用。首先檢測了這三個miRNA在牙鲆成體不同組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-1和miR-133a主要在心臟和肌肉中表達，miR-206a主要在肌肉中表達。接下來檢測了這三個miRNA在牙鲆正常、甲狀腺素促進和硫脲抑制的變態(tài)發(fā)育過程中的表達情況，結(jié)果顯示，在變態(tài)過程中甲狀腺素能顯著促進miR-1和miR-206a的表達，在一定程度上抑制miR-133a的表達。為了進一步去探討這三個miRNA的功能

8、，我們利用miRNA靶基因預(yù)測程序RNAhybrid預(yù)測了它們的靶基因，結(jié)果得到了13個miR-1的候選靶基因，8個miR-133a的候選靶基因以及16個miR-206a的候選靶基因。已有研究顯示，在肌肉發(fā)育中，miR-1和miR-206促進成肌細胞的分化，miR-133抑制成肌細胞的分化而促進成肌細胞的增殖。因此，我們推測，在牙鲆變態(tài)發(fā)育早期，甲狀腺素促進了miR-1和miR-206a的表達，啟動了成肌細胞的分化，促進了牙鲆的幼體型肌

9、肉轉(zhuǎn)變?yōu)槌审w型肌肉，從而進一步加速了牙鲆的變態(tài)過程，其詳細的分子調(diào)控機制還有待于進一步實驗研究。
　　MyoD、Myf5和Myogenin是肌肉發(fā)育中起關(guān)鍵作用的肌肉調(diào)節(jié)因子，它們在肌肉發(fā)育早期的成肌細胞的決定、分化以及增殖中發(fā)揮著重要的作用。并且已有研究顯示，MyoD、Myf5和Myogenin在肌肉發(fā)育相關(guān)的miR-1、miR-133和miR-206的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也扮演著重要的作用。因此，我們分析了這三個肌肉調(diào)節(jié)因子在牙鲆變態(tài)發(fā)

10、育過程中的表達情況，旨在探討它們在牙鲆變態(tài)發(fā)育中對肌肉發(fā)育的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，在牙鲆變態(tài)發(fā)育期間，MyoD高豐度表達，在變態(tài)早期，甲狀腺素顯著促進它的表達，在變態(tài)后期硫脲抑制了它的表達;Myf5的表達顯著低于MyoD的水平，但在整個變態(tài)期間，甲狀腺素對它的促進作用最顯著，而在變態(tài)后期，其表達水平也明顯受到硫脲的抑制;Myogenin的表達最弱，在變態(tài)后期，甲狀腺素抑制了它的表達，而硫脲卻顯著地促進它的表達。這說明MyoD、Myf5以及