菲律賓蛤仔附著變態(tài)過程中的差異基因表達與基因克隆.pdf

1、菲律賓蛤仔(RuditapesphilippinarumAdamsetReeve)又稱蛤仔，廣泛分布在我國黃、渤海海區(qū)，其肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，為我國四大養(yǎng)殖貝類之一，是捕撈和人工養(yǎng)殖的對象。隨著人們生活水平的日益提高，市場對該貝苗種的需求亦日益增加。附著變態(tài)過程是貝類生活史中的關健時期，是幼蟲向成體轉變的重要環(huán)節(jié)。蛤仔苗種的產量和質量在很大程度上取決于幼苗的附著變態(tài)過程，幼苗附著變態(tài)的成功與否往往決定著出苗量和育苗的成敗。因此研究其受精

2、生物學、胚胎發(fā)生、附著、變態(tài)等基礎生物學的工作已引起科研工作者的重視，然而從分子水平方面闡明附著變態(tài)機理的研究還不太深入。本論文以菲律賓蛤仔附著變態(tài)時期的幼苗為實驗材料，采用分子生物學技術，試圖從分子水平上找出與菲律賓蛤仔附著變態(tài)及發(fā)育相關的基因，為貝類幼苗發(fā)育生物學，生理學及分子生物學的發(fā)展提供參考，同時為苗種業(yè)的開發(fā)提供一定的基礎理論依據(jù)。主要結果如下：1.采用DDRT-PCR技術，以受精后殼頂前期、殼頂期、眼點期、稚貝期的菲律賓蛤

3、仔幼蟲為實驗對象，研究菲律賓蛤仔幼蟲不同發(fā)育時期的基因表達，進而找出與菲律賓蛤仔附著變態(tài)相關的基因。 2.研究了腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、γ-氨基丁酸、KCl和CaCl2，在不同劑量和不同的誘導持續(xù)時間下，對菲律賓蛤仔眼點幼蟲附著變態(tài)的誘導作用。在此基礎之上，選取出最佳而又經濟的神經遞質類物質腎上腺素(使用濃度為10-6M，誘導時間為4h)，同樣也采用DDRT-PCR技術，6組引物組合，擴增出343條帶，67條具有明顯表達

4、差異，其中的18條在對照組中有高表達，而另外的49條差異帶在實驗組中有高表達，表明這些差異帶所代表的基因都和腎上腺素誘導有關，同時也從分子生物學水平上證明了腎上腺素參與了貝類附著變態(tài)機理的調控過程。 3.以菲律賓蛤仔眼點幼蟲為實驗材料，應用RACE技術，克隆了菲律賓蛤仔的replacementhistoneH3.3的全長cDNA序列(AY916800);菲律賓蛤仔H3.3的基因組序列擴增結果表明：序列L[AY916802]大小為

5、1214bp，含有一個長803bp的內含子;另一序列S[AY916803]長約411bp，不具有內含子。序列L和S編碼和H3.3完全相同蛋白質序列，這表明菲律賓蛤仔的H3.3cDNA可能有多個序列編碼，也可能序列L為菲律賓蛤仔的H3L-like序列。在這個研究中，我們還克隆了菲律賓蛤仔的組蛋白H3基因序列，分析表明H3和H3.3編碼的蛋白質序列只有四個氨基酸的差異，表明H3和H3.3及H3L-like存在著密切的關系，因此我們對它們特殊

6、進化地位及復制依賴性的組蛋白和復制不依賴的組蛋白進化起源進行了討論。本研究支持histoneH3.3為H3的祖先基因的觀點，但我們認為H3L-1ike可能是組蛋白基因進化過程中的過渡基因，而非祖先基因。原位雜交實驗表明H3.3在外套膜及鰓的特異性部位都有較大量的表達，后期正在進行菲律賓蛤仔不同發(fā)育時期的胚胎及其它組織和器官的原位雜交實驗。構建pGEX-4T-H3.3表達載體，轉化原核生物DH5α受體菌后，在蛋白上清液中得到很好的表達，W