黃鱔性腺發(fā)育過程中差異表達(dá)基因的篩選.pdf

1、黃鱔(Monopterus albus)卵巢的石蠟切片表明：卵黃發(fā)生晚期(GSI為16.7﹪)的卵巢與處于卵黃發(fā)生中期(GSI為3.7﹪左右)的卵巢在結(jié)構(gòu)上有明顯的差別，并且在卵黃發(fā)生晚期的卵巢中有較為明顯的雄性組織。應(yīng)用抑制性差減雜交(Suppression Subtraction Hybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建了這兩個(gè)時(shí)期性腺抑制性差減文庫。從中隨機(jī)挑取1200個(gè)克隆進(jìn)行了PCR和斑點(diǎn)雜交篩選，得到140差異表達(dá)的cD

2、NA片段。挑選了95個(gè)cDNA克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank檢索和生物信息學(xué)比較分析，其中80個(gè)片段與已知的序列有較高同源性，另外有15個(gè)片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有明顯同源性的基因。在正向文庫(Fs)找出一系列呼吸鏈上的相關(guān)基因的片段，包括NADH脫氫酶(NADH dehydrogenase)subunit 1和4，細(xì)胞色素b(cytochrome b，Cytb)，細(xì)胞色素C氧化酶(cytochromec oxidase)subun

3、it 1、2和3；ATP合成酶(ATPase)subunit 6，此外還找到載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因片段，solute carrier family 44，member 3基因片段；在反向庫(Rs)找到與虹鱒(Oncorhynchus mykiss)C型甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)有較高同源性的基因。 我們還建立了這兩個(gè)時(shí)期卵巢的SMART cDNA

4、文庫及其cDNA差減文庫。從中隨機(jī)挑取了1000個(gè)克隆，進(jìn)行了PCR和斑點(diǎn)雜交篩選，得到80個(gè)差異表達(dá)的cDNA片段，挑選了50個(gè)cDNA克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank檢索和生物信息學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)其中13個(gè)片段與報(bào)道的基因有較高的同源性。在正向(SFs)除了找到的上述呼吸鏈上的相關(guān)基因NADH脫氫酶subunit 1外，還發(fā)現(xiàn)PR/SET domain containing protein 8a基因，hydroxyl-delta-5-

5、steroid dehydrogenase,3 beta- and steroid delta-isomerase 7基因， VHSV-induced protein基因， short-chain Dehydrogenase/reductase(SDR family)member 7基因以及BMS1-like,ribosome assembly protein基因片段。在反向(SRs)中，找到Dab2 protein，TSC22 dom

6、ain family，egg envelope glycoprotein，BTB(POZ)domain containing 8，isoform CRA_c，以及zonadhesin基因片段。另外，還發(fā)現(xiàn)一些片段與原核生物基因有較低的同源性，有25個(gè)片段與GenBank中序列無明顯的同源性。應(yīng)用半定量RT-PCR初步分析了上面所獲得的黃鱔Cox Ⅰ和ApoE基因在不同性腺發(fā)育階段的表達(dá)，結(jié)果表明：在GSI>5﹪的卵巢中表達(dá)明顯升高，這與