噬菌體展示技術篩選腦靶向功能肽及其修飾納米粒的腦內(nèi)遞藥研究.pdf

1、阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是四大常見的神經(jīng)退行性疾病之一。在65歲以上的人群中，大約10％患有AD。隨著人口老齡化，這一疾病的危害愈加突出；此外AD還逐步呈現(xiàn)年輕化趨勢。AD給患者及家屬的生活質(zhì)量帶來很大影響，同時也給社會帶來很大壓力。AD的治療已成為亟待解決的重要問題。
　　 文獻報道，多種蛋白多肽藥物(如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性纖維生長因子等)具有神經(jīng)保護作用，為神經(jīng)退行性疾病

2、如AD的治療帶來希望。但是，這些多肽蛋白類藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性差，易受酶降解，血中半衰期短；并且由于血腦屏障的存在使得這類藥物難以入腦，不能實現(xiàn)直接給藥用于腦部疾病的治療。因此對于蛋白多肽類藥物腦內(nèi)遞釋的研究具有很高的科學價值和臨床意義。
　　 為了增加藥物透過血腦屏障，目前研究最為關注，也最具前景的策略是將納米載藥系統(tǒng)經(jīng)受體介導胞吞轉(zhuǎn)運入腦。但是目前報道的介導入腦的靶向功能基如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和OX26等都存在體內(nèi)內(nèi)源性蛋白飽和及

3、競爭抑制問題，從而影響其介導入腦的效果。為了解決上述難題，本文采用噬菌體展示技術主動篩選新型的靶向功能基，并獲得對小鼠腦部具有靶向性的噬菌體展示短肽TGN和CTY。該展示短肽具有低免疫原性、高靶向性和易于修飾的優(yōu)點，并可以解決上述內(nèi)源性飽和的問題。將篩選得到的噬菌體展示肽以共價連接的方式修飾到聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)納米粒表面，由此構(gòu)建新型的腦靶向遞藥系統(tǒng)。通過PEG-PLGA納米粒包載蛋白多肽藥物可以保護其不

4、受體內(nèi)環(huán)境降解，提高穩(wěn)定性；納米粒表面修飾的噬菌體展示肽可以發(fā)揮腦靶向作用而介導載藥納米粒入腦，提高對中樞疾病的治療效果。
　　 本文第一部分為噬菌體展示技術篩選腦靶向功能肽，實驗選擇兩種噬菌體肽庫進行體內(nèi)親和篩選。利用Ph.D.-C7C肽庫，經(jīng)過篩選方式和篩選條件的優(yōu)化，在多輪體內(nèi)親和篩選后獲得五個單克隆噬菌體。其中三個單克隆噬菌體展示相同的序列，為CTSTSAPYC，其重復率為7.14％；其余兩個單克隆噬菌體展示另一條序列，

5、為CPMKSHTNC，其重復率為4.76％。將前者命名為Clone7-19，將其展示的基序即CTSTSAPYC命名為CTY肽。同樣，利用Ph.D.-12肽庫篩選獲得一條序列為TGNYKALHPHNG的展示肽，其重復率高達60％，將其命名為TGN肽，展示TGN肽的噬菌體命名為Clone12-8。CTY連接FITC后(FITC-CTY)的活體分布顯示其具有較好的腦靶向性。Clone12-8在免疫組化小鼠體內(nèi)分布考察和熒光標記后(FITC-T

6、GN)的活體分布結(jié)果顯示也具有良好的腦靶向性。但這兩條展示肽都較易被腎排泄，難以有效發(fā)揮腦靶向效果。
　　 為了使上述展示肽能在體內(nèi)長時間發(fā)揮腦靶向性，第二部分進一步將展示肽與具有體內(nèi)長循環(huán)特性的PEG-PLGA納米粒相結(jié)合，共同構(gòu)建一類新型、高效的腦靶向遞釋系統(tǒng)。第二部分第一章采用乳化/溶媒蒸發(fā)法制備普通納米粒(Nanoparticle，NP)，通過納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基團(Maleimide，MAL)與展示肽T

7、GN末端的巰基共價反應，將展示肽結(jié)合到納米粒表面(TGN-NP)，并對TGN-NP制備中的若干條件進行了優(yōu)化，確定以下條件：聚合物加入的總量為每份25mg，MePEG-PLGA與MAL-PEG-PLGA的比例為4:1，馬來酰亞胺基與蛋白巰基的反應摩爾比為3:1，兩者的反應時間為6～8 h。按優(yōu)化工藝制備的TGN-NP粒徑在89 nm左右，Zeta電位在-24 mV左右，表面連接的TGN數(shù)目在195左右。利用納米粒包載近紅外染料DiR，通

8、過小動物活體成像儀比較了NP、表面低密度修飾的TGN-NP(3:1)、高密度修飾的TGN-NP(1:1)以及高密度修飾的CTY-NP(1:1)尾靜脈注射裸鼠后的活體分布及腦內(nèi)遞藥特性。結(jié)果表明，TGN肽高密度修飾的納米粒具有較好的腦靶向性，且顯著優(yōu)于CTY肽高密度修飾納米粒、TGN肽低密度修飾納米粒及NP，其能有效增加納米粒的入腦量，而一定程度減少肝、腎等組織中的納米粒聚集，有望作為腦靶向功能基介導更多藥物入腦。
　　 第二部分

9、第二章對TGN-NP的腦內(nèi)遞藥特性和毒性進行了體外評價。制備了載香豆素-6的NP和TGN-NP，體外泄漏實驗證明，包載在NP和TGN-NP中的香豆素-6在pH4.0和pH7.4.介質(zhì)中的泄漏率均較低，提示可用于示蹤納米粒的體外行為。bEnd.3細胞攝取載香豆素-6的NP和TGN-NP的定性觀察結(jié)果顯示，在30、60、120 min時，細胞對TGN-NP的攝取均顯著高于NP。定量實驗結(jié)果表明，bEnd.3細胞在不同納米粒濃度、不同溫度及不

10、同時間條件下對TGN-NP的攝取均顯著高于NP，且TGN-NP的攝取呈現(xiàn)時間、濃度和溫度依賴性。說明bEnd.3細胞對于TGN-NP的攝取是一個主動轉(zhuǎn)運過程。胞吞抑制實驗提示，TGN肽對TGN-NP胞吞轉(zhuǎn)運起著競爭抑制作用，TGN-NP主要通過穴樣凹陷和巨胞飲兩條途徑被bEnd.3細胞內(nèi)吞，并且該過程為高爾基體和溶酶體參與的能量依賴過程。細胞活力測定結(jié)果顯示，在0.1～10mg/mL的濃度范圍內(nèi)，NP、TGN-NP和TGN為RGR的0～

11、1級，具有良好的安全性。TGN-NP是一種有效、低毒的腦靶向藥物遞釋系統(tǒng)。
　　 第二部分第三章對TGN-NP的腦內(nèi)遞藥特性進行了體內(nèi)評價。建立了香豆素-6全血樣品、組織樣品測定方法，該方法專屬性強，標準曲線的線性關系良好，精密度、回收率符合生物樣品測定要求。小鼠尾靜脈注射載香豆素-6的TGN-NP(劑量為50μg/kg香豆素-6)1 h后腦切片的結(jié)果顯示，TGN-NP在第三腦室、皮層及海馬區(qū)域的分布均顯著高于NP。以香豆素-6

12、作為熒光探針，以NP作對照，采用藥動學方法考察了TGN-NP(3:1)和TGN-NP(1:1)的腦內(nèi)遞藥特性，ICR小鼠尾靜脈注射TGN-NP(3:1)和TGN-NP(1:1)的腦靶向指數(shù)分別為2.83和3.78，腦靶向效果良好：TGN肽的修飾能有效提高納米粒的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運。其他組織的分布結(jié)果表明，NP和TGN-NP主要分布在脾，其次是肝和肺。CD68細胞染色的急性毒性實驗結(jié)果顯示，高劑量(180 mg/kg)的TGN-NP不會引起B(yǎng)alb

13、/c鼠大腦、小腦、心和肺的巨噬細胞增多，僅對肝和腎產(chǎn)生短暫的、一過性的輕微毒性，低劑量的TGN-NP不會引起脾的急性毒性反應。
　　 第二部分第四章將TGN-NP包載具有神經(jīng)保護作用的多肽藥物NAP，研究其用于多肽蛋白藥物腦內(nèi)遞送的可行性。采用復乳/溶媒蒸發(fā)法制備載多肽藥物NAP的NP(NP/NAP)；與TGN肽共價連接后制備載NAP的TGN-NP(TGN-NP/NAP)；其粒徑均在150 nm左右，Zeta電位約為-19 mV

14、。采用雙側(cè)海馬定位注射Aβ1-40聚集肽構(gòu)建小鼠AD模型，通過Morris水迷宮實驗評價NAP制劑對于小鼠學習能力及空間記憶障礙的治療和改善作用。通過測定小鼠腦皮層與海馬中乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力以及病理切片評價NAP制劑對中樞膽堿能神經(jīng)元的保護作用。根據(jù)行為學研究、生化指標和病理切片結(jié)果，NAP溶液直接靜脈注射或是皮下注射對于Ap1-40所致小鼠老年性癡呆無改善作用，即使皮下注射劑量提高5倍(10μg/kg)，對記憶能力及生化

15、指標等的改善作用仍然不夠理想。將NAP包載入NP后，能提高NAP在動物體內(nèi)的穩(wěn)定性，因此一定程度上改善小鼠的空間記憶障礙，但是NP/NAP在高劑量時(4μg/kg)仍未能使Aβ1-40所致小鼠老年性癡呆的記憶能力及生化指標恢復至正常水平。而將包載NAP的納米粒表面修飾TGN后，能夠顯著提高NAP腦內(nèi)遞送的效率，在劑量比。NAP溶液靜脈注射及皮下注射低一倍的情況下(1μg/kg)，已經(jīng)能夠產(chǎn)生明顯的空間記憶改善作用，而將劑量提至2μg/k