大腸桿菌中5-氨基酮戊酸合酶（ALAS）系列新型融合表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化.pdf

1、5-氨基酮戊酸合酶(5-Aminolevulinic acid，ALAS)存在于所有的生物體內(nèi)，是C4途徑中血紅素合成代謝的限速酶，催化琥珀酰輔酶A和甘氨酸縮合成ALA，CoA和CO<,2>。ALA是合成卟啉、血紅素、葉綠素、維生素B12等四吡咯化合物的代謝中間體，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用，不僅可作為除草劑、殺蟲(chóng)劑，還可提高植物的抗鹽、抗冷凍能力，這對(duì)于緩解生態(tài)環(huán)境惡化，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。此外，5-氨基酮戊酸也被廣泛

2、用于腫瘤的癥斷及癌癥的治療方面。目前，由于不易獲得大量天然ALAS而阻礙對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的研究。本實(shí)驗(yàn)為了獲得天然蛋白，構(gòu)建了三種新型ALAS融合表達(dá)載體(pET-HMA，pET-HGA，pET-HDA)。把含有外源片段的三種載體分別轉(zhuǎn)入BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)鎳柱一步純化可獲得高純度的ALAS重組蛋白。本實(shí)驗(yàn)主要獲得如下結(jié)果： 1．根據(jù)已公布的heml基因的全序列，以釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae

3、)基因組為模板，去除N端導(dǎo)肽序列的核苷酸序列，以編碼Asn63為第一個(gè)氨基酸殘基，上游引物編碼的起始氨基酸為Met，設(shè)計(jì)并合成引物，采用PCR擴(kuò)增出一個(gè)大小約為1.4-1.5 kb的特異DNA片段，進(jìn)一步測(cè)序表明同已公布的釀酒酵母heml基因片段的序列完全相同。 2．成功的構(gòu)建了AIAS三種新型融合表達(dá)載體：pET-HMA，pET-HGA和pET-HDA三種融合表達(dá)的蛋白在N端都具有六個(gè)組氨酸和三種最常用的具有增加可溶性表達(dá)的

4、標(biāo)簽(GST，MBP，DHFR)，并且融合蛋白中具有TEV蛋白酶的切割位點(diǎn)。 3．pET-HMA，pET-HGA和pET-HDA三種融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，通過(guò)SDS-PAGE分析表明三種融合的蛋白：MBP/ALAS，GST/ALAS，DHFR/ALAS都為可溶性表達(dá)且表達(dá)量有顯著的提高。MBP/ALAS未能獲得完整的融合蛋白，在MBP與ALAS之間在胞內(nèi)發(fā)生了斷裂，推測(cè)可能的原因是MBP與ALAS連接的肽鏈過(guò)

5、長(zhǎng)暴露在融合蛋白外被胞內(nèi)蛋白酶水解。本實(shí)驗(yàn)獲得了GST/ALAS和DHFR/ALAS融合表達(dá)的蛋白，分子量都為70kD。表明擔(dān)體蛋白GST和DHFR能促進(jìn)ALAS正確折疊和增加其可溶性表達(dá)。 4．帶有His-Tag的融合蛋白GST/ALAS和DHFR/ALAS經(jīng)鎳柱一步純化后，SDS-PAGE分析表明純化都為均一的一條帶。表明利用His-Tag篩選和純化目的蛋白是一種快速而有效的方法綜上所述，本文已成功地從釀酒酵母基因組克隆出