BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化及體外活性測(cè)定.pdf

1、神經(jīng)退行性疾病,如老年性癡呆(Alzheimer's disease AD)、帕金森氏癥(Parkinson's disease PD)、萎縮性側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、和亨廷頓氏病(Huntington's disease HD)等,臨床表現(xiàn)為肢體運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶等功能障礙,主要原因是神經(jīng)元功能的缺失或死亡。目前沒有理想的治療手段,在我國AD和PD這兩種疾病已經(jīng)累及大約1000萬人,

2、給個(gè)人家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。研究表明,神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員(neurotrophic factors,NTFs)等,顯示了很好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病的治療前景[2]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員包括之一,與其特異性受體酪氨酸激酶家族成員trkB結(jié)合,激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,而發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)生物活性[3]。
　　 然而,血腦屏障(BBB)阻礙了大分子藥物從血液中進(jìn)入大腦發(fā)揮生理作用,人大腦血腦屏

3、障(BBB)由血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接組成,BBB腔內(nèi)面為血液,腔外面多為外膜細(xì)胞,星行細(xì)胞及少量的神經(jīng)元。天然BDNF不能透過BBB進(jìn)入大腦發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)活性[5]。
　　 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain,PTD),如來源于人類Ⅰ型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Trans-activator transcription,TAT)的PTD,是一類富含正電荷能夠?qū)⑴c其物理或化學(xué)連接的化合物、蛋白質(zhì)

4、、或核酸類分子,帶過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞漿,胞核內(nèi),甚至BBB,發(fā)揮各自的生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域。PTD/TKT介導(dǎo)的蛋白質(zhì)可穿過由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的BBB,使所攜帶蛋白進(jìn)入大腦發(fā)揮生理作用,而使一些在正常情況下是不能通過BBB的蛋白進(jìn)入腦組織。
　　 本實(shí)驗(yàn)中心前期通過基因工程的方法成功制備了編碼成熟BDNF-TAT融合蛋白的基因,目的在于在世界上首先制備一種能通過BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),治療神經(jīng)退行性疾病的基因重組神經(jīng)營養(yǎng)因子藥物制

5、劑。
　　 基于前期研究,本文采用重組質(zhì)粒PET-30(a)-BDNF-TAT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS中優(yōu)化表達(dá),經(jīng)陽離子交換樹脂優(yōu)化純化及精氨酸倍比稀釋法復(fù)性BDNF-TAT融合蛋白,尾靜脈給藥KM種小鼠后研究其腦靶向性及其在腦組織中的分布,體外培養(yǎng)SD大鼠新生一周鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元檢測(cè)BDNF-TAT融合蛋白的生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究可透過血腦屏障藥物BDNF-TAT融合蛋白治療神經(jīng)退行性疾病提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

6、
　　 目的
　　 1.研究重組質(zhì)粒PET-30(a)-BDNF-TAT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS后BDNF-TAT融合蛋白的表達(dá),并優(yōu)化BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)及純化的條件；
　　 2.小鼠經(jīng)尾靜脈血管給予復(fù)性后BDNF-TAT融合蛋白,探討其在小鼠腦組織中的腦靶向性及在小鼠腦組織中的分布；
　　 3.體外培養(yǎng)新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞,進(jìn)一步研究復(fù)性后BDNF-TAT

7、融合蛋白體外促進(jìn)神經(jīng)元存活生長(zhǎng)的活性。
　　 方法
　　 1.根據(jù)前期課題組經(jīng)基因工程辦法制備的重組質(zhì)粒PET-30(a)-BDNF-TAT及,本文將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS,37℃,1.0mM IPTG誘導(dǎo)4h后低溫離心(4℃,5000 rpm)收集菌體,超聲裂解,高速離心后收集各步驟樣品,通過15％SDS-PAGE和 Western Blot分析確定融合蛋白BDNF-TAT在大腸桿菌中的表

8、達(dá)形式；分別選取25℃、30℃、33℃、37℃、40℃為不同的誘導(dǎo)溫度,對(duì)誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化；分別選取0.1mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM為IPTG誘導(dǎo)濃度,對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度經(jīng)行優(yōu)化；選取1、2、4、6、8為誘導(dǎo)時(shí)間,對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間經(jīng)行優(yōu)化；收集各條件下大腸桿菌并經(jīng)行15％SDS-PAGE和WesternBlot分析確定BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件。
　　 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后,經(jīng)25℃,0.

9、5mM IPTG誘導(dǎo)4h后離心收集濕菌體,PBS重懸洗滌后用60％強(qiáng)度超聲破碎儀裂解大腸桿菌,4℃、12000rpm低溫高速高速離心去上清,沉淀用2M尿素和0.4％DOC洗滌并重復(fù)洗滌一次,低溫高速離心去上清,包涵體沉淀用8M尿素4℃攪拌溶解14h,溶解后蛋白通過中高壓層析系統(tǒng)泵入SP-Sepharose陽離子交換柱,選取pH7.0 NaCl濃度分別為0.1M和0.5M的洗脫液經(jīng)行梯度沈脫優(yōu)化不同離子強(qiáng)度對(duì)目的蛋白的沈脫能力；選取pH8

10、.5,NaCl濃度為0.5M的洗脫液洗脫目的蛋白,對(duì)掛柱的目的蛋白經(jīng)行分離純化。洗脫后目的蛋白用0.4M精氨酸倍比稀釋法除去目的蛋白中的尿素,同時(shí)復(fù)性融合蛋白BDNF-TAT。收集各步驟蛋白樣品進(jìn)行15％SDS-PAGE和Western Blot分析,確定最終過柱純化優(yōu)化方案。
　　 3.隨機(jī)取9只KM種小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分為給藥組,陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,每組3只,將純化復(fù)性后的BDNF-TAT融合蛋白溶解于適量生理鹽水,給藥

11、組動(dòng)物尾靜脈注射4μg BDNF-TAT,而陰性對(duì)照組給予等體積生理鹽水,空白對(duì)照組不給藥。4h后斷頭取鬧組織,全蛋白提取試劑盒提取腦組織中全蛋白,免疫印跡法(Western Blot)鑒定腦組織中所含BDNF-TAT,對(duì)所有組中目的蛋白以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行上樣量標(biāo)準(zhǔn)化后,以BDNF-TAT與β-actin灰度值之比為腦組織中BDNF-TAT相對(duì)含量,應(yīng)用單向方差分析方法,比較給藥組,陰性對(duì)照組賀空白組之間BDNF-TAT的相對(duì)

12、含量是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.隨機(jī)取6只KM種小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分為給藥組和陰性對(duì)照組,每組3只,將純化復(fù)性后的BDNF-TAT溶解于適量生理鹽水,給藥組動(dòng)物尾靜脈注射4μg BDNF-TAT,而陰性對(duì)照組給予等體積生理鹽水,4h后灌注4％多聚甲醛,斷頭取腦組織,小鼠腦組織4％多聚甲醛浸泡2h后浸入30％蔗糖溶液過夜,10μ m厚度冰凍切片。切片用SABC免疫組織化學(xué)法鑒定BDNF-TAT在小鼠腦組織中的分布。
　　

13、 5.摘取新生一周左右SD大鼠背根神經(jīng)節(jié),經(jīng)膠原酶Ⅳ和0.25％胰蛋白酶消化后用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。將神經(jīng)元細(xì)胞分為給藥組,陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組,給藥組中DMEM培養(yǎng)基加入100ng/ml復(fù)性后融合蛋白BDNF-TAT,陽性對(duì)照組中DMEM培養(yǎng)基加入100ng/ml NGF,空白對(duì)照組中DMEM培養(yǎng)基不加入神經(jīng)營養(yǎng)因子。培養(yǎng)基每2天換一次液,培養(yǎng)4天后用AChE神經(jīng)元染色方法對(duì)神經(jīng)元經(jīng)行染色,觀察神

14、經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　 結(jié)果
　　 1.通過15％SDS-PAGE和Western Blot鑒定BDNF-TAT,大腸桿菌中表達(dá)BDNF-TAT融合蛋白在分子量約18kD處有表達(dá),且在大腸桿菌裂解沉淀中目的蛋白較多,說明BDNF-TAT融合蛋白以包涵體沉淀形式存在；經(jīng)不同溫度,IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間經(jīng)行優(yōu)化后,誘導(dǎo)溫度在25℃,IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5mM誘導(dǎo)4h時(shí)BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量最高。

15、
　　 2.經(jīng)15％SDS-PAGE和Western Blot分析,包涵體蛋白經(jīng)2M尿素和0.4％DOC洗滌后大部分雜蛋白被洗滌干凈,且8M尿素將大部分包涵體蛋白溶解,溶解后蛋白經(jīng)SP-Sepharose陽離子交換柱純化后,大部分目的蛋白被pH8.5、NaCl濃度為0.5 M的洗脫液洗脫下來,0.4M精氨酸復(fù)性后蛋白純度約為90％,每升菌能產(chǎn)出約4.8 mg目的蛋白。
　　 3.Western Blot鑒定腦組織中BDN

16、F-TAT相對(duì)含量,對(duì)ECL發(fā)光顯影膠片中給藥組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中BDNF-TAT和β-actin的灰度掃描,以BDNF-TAT和β-actin的灰度比值作為各組中BDNF-TAT蛋白的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果以(x)±s表示,給藥組中BDNF-TAT蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.897±0.286,陰性對(duì)照組中BDNF-TAT蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.615±0.234,空白對(duì)照組中BDNF-TAT蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.335±0.154。Lev

17、ene檢驗(yàn)方差齊性(P=0.447>0.05),方差齊。經(jīng)單方向方差分析,各組間BDNF-TAT蛋白相對(duì)表達(dá)量有差異(F=39.019,P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LSD法組間多重比較:給藥組中BDNF-TAT相對(duì)表達(dá)量與陰性對(duì)照組中BDNF-TAT相對(duì)表達(dá)量相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥組中BDNF-TAT相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組中BDNF-TAT相對(duì)表達(dá)量相比(P=0.000<0.05),差

18、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而陰性對(duì)照組中BDNF-TAT相對(duì)表達(dá)量和空白對(duì)照組中BDNF-TAT相對(duì)表達(dá)量相比(P=0.188>0.05),差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明BDNF-TAT通過外周給藥能靶向至小鼠腦組織。
　　 4.SABC免疫組織化學(xué)法鑒定BDNF-TAT經(jīng)尾靜脈給藥KM種小鼠后其在腦組織中的分布,給藥組中融合蛋白BDNF-TAT陽性染色明顯較強(qiáng),而生理鹽水組中陽性染色明顯弱于給藥組,其陽性染色主要分布于海馬區(qū)CA1、CA3和D

19、G區(qū)。AChE染色神經(jīng)元后,空白對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)4天后胞體較小,細(xì)胞大部分死亡,突起較短。而給藥組組和陽性對(duì)照組中神經(jīng)元生長(zhǎng)良好,突起較長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)目明顯較空白對(duì)照組多。每組孔中隨機(jī)選取10個(gè)視野,經(jīng)Image ProPlus6.0軟件測(cè)量細(xì)胞最長(zhǎng)突起的長(zhǎng)度,結(jié)果以(x)±s表示,結(jié)果給藥組為143±13um,陽性對(duì)照組為154±13um,而空白對(duì)照組為64±15um,Levene檢驗(yàn)方差齊性(F=0.039,P=0.961>0.05

20、),方差齊。經(jīng)單方向方差分析,各組間最長(zhǎng)突起的長(zhǎng)度有差異(F=126.523,P=0.000),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LSD法組間多重比較:給藥組中最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度與陽性性對(duì)照組中最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度相比(P=0.087>0.05),差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而給藥組中最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度與空白對(duì)照組中最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；陽性對(duì)照組中最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度與空白對(duì)照組中最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

21、說明BDNF-TAT在體外有能促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)。
　　 通過Image Pro Plus6.0軟件測(cè)量神經(jīng)元胞體總面積,結(jié)果給藥組為2686±242um2,陽性對(duì)照組為2864±169um2,而空白對(duì)照組為397±97um2。Levene檢驗(yàn)方差齊性(F=0.039,P=0.047<0.05),方差不齊。經(jīng)Welch分析,各組間神經(jīng)元胞體總面積有差異(F=997.983,P=0.000),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Dunnett T3

22、法組間多重比較:給藥組中神經(jīng)元胞體總面積與陽性性對(duì)照組中神經(jīng)元胞體總面積相比(P=0.199>0.05),差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而給藥組中神經(jīng)元胞體總面積與空白對(duì)照組中神經(jīng)元胞體總面積相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；陽性對(duì)照組中神經(jīng)元胞體總面積與空白對(duì)照組中神經(jīng)元胞體總面積相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證明BDNF-TAT在體外有保護(hù)神經(jīng)元生長(zhǎng)和存活的生物學(xué)活性。
　　 結(jié)論
　　

23、 1.BDNF-TAT融合蛋白能通過重組質(zhì)粒PET-30(a)-BDNF-TAT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS中以包涵體形式表達(dá),分子量約為18kD左右。
　　 2.包涵體蛋白經(jīng)表達(dá)純化優(yōu)化并復(fù)性后,得到高純度活性BDNF-TAT融合蛋白,每升菌產(chǎn)出目的蛋白約4.8mg,純度約為90％。
　　 3.尾靜脈注射復(fù)性后融合蛋白BDNF-TAT經(jīng)Western Blot分析后,給藥組小鼠腦組織中BDNF-TAT的相

24、對(duì)含量較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯高(P>0.05),且陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組中BDNF-TAT的相對(duì)含量無差異(P<0.05),證明復(fù)性后融合蛋白BDNF-TAT能通過外周尾靜脈給藥靶向至小鼠腦組織中。
　　 4.SABC免疫組織化學(xué)法證明BDNF-TAT融合蛋白經(jīng)外周尾靜脈給藥小鼠后,腦組織中BDNF-TAT主要分布在海馬區(qū)CA1、CA3和DG區(qū)。
　　 5.體外培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞表明,BDNF-TAT融合蛋白