肝素衍生物靶向MMPs高表達(dá)抗腫瘤侵襲研究.pdf

1、癌癥致死率高，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。導(dǎo)致癌癥高致死率的重要原因之一是其的高侵襲和高轉(zhuǎn)移特性。以肝癌為例，手術(shù)切除及術(shù)后輔助治療雖一定程度上可延長患者生存期，但由于肝癌的高侵襲和轉(zhuǎn)移特點(diǎn)，其預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率高。
　　腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜進(jìn)程，主要過程包括:①腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離;②腫瘤細(xì)胞遷移到血管或淋巴管;⑨腫瘤細(xì)胞穿透血管腔;④逃脫免疫系統(tǒng);⑤在遠(yuǎn)處與血管內(nèi)皮粘附;⑥從血管中溢出到新的組織;⑦在新宿主組織中腫瘤細(xì)

2、胞存活并生長。其中，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)和細(xì)胞基底膜(Basement memBrane，BM)的降解涉及到侵襲和轉(zhuǎn)移的多個(gè)階段，是其中的重要步驟之一。
　　正常情況下，ECM和BM是機(jī)體中高度有序的屏障結(jié)構(gòu)，主要成分為Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等，其中Ⅳ型膠原為最主要成分。在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞通過釋放多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metall

3、oproteinases，MMPs)和乙酰肝素酶（Heparinase，HPA），降解ECM和BM，促進(jìn)癌細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中，MMPs可降解多種膠原蛋白，在ECM和BM降解過程中發(fā)揮著重要作用，近年來已成為抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的熱門靶點(diǎn)之一。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs是一類依賴于Zn2+，Ca+的內(nèi)肽酶，目前已發(fā)現(xiàn)20余種，其在胚胎發(fā)育、免疫、血管生成、炎癥、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮著重要作用。MMPs家族結(jié)構(gòu)具有同源性

4、，均由三個(gè)保守序列組成，分別為N端前肽區(qū)、催化區(qū)和C端血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域。正常情況下，MMPs在體內(nèi)表達(dá)水平較低，但研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中，MMPs表達(dá)會異常升高，通過降解ECM和BM，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。
　　MMPs在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。MMPs，尤其是MMP-2、-9，可降解ECM和BM中的多種膠原，使原本隱藏在基底膜的相關(guān)位點(diǎn)暴露出來，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。同時(shí)，MMPs通過降解ECM，釋放貯存在E

5、CM中的多種生長因子促進(jìn)腫瘤發(fā)展。此外，MMPs還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞間的粘附作用，促進(jìn)腫瘤新生血管生成等?？傊?，MMPs在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及腫瘤組織的血管生成過程中都起到了十分關(guān)鍵的作用。因此MMPs，特別是MMP-2、-9成為近來抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)之一。
　　MMPs在正常組織中表達(dá)水平較低，其表達(dá)與調(diào)控主要包括基因表達(dá)調(diào)控、酶原活化過程的調(diào)控和MMPs天然抑制物的調(diào)節(jié)三個(gè)方面。MMPs基因的啟動子內(nèi)含多種轉(zhuǎn)錄因子

6、結(jié)合位點(diǎn)，如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κβ、激活蛋白-1(AP-1)位點(diǎn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)、Ets transcription factors PEA3等，多種因素均可誘導(dǎo)或抑制其轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化，從而啟動或抑制MMPs表達(dá)。MMPs以酶原形式分泌，只有被激活后才具有降解BM和ECM的活性，人體內(nèi)存在天然的MMPs特異抑制劑，稱之為組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor ofmetalloproteinas，T

7、IMPs)，包括TIMP-1、-2、-3、-4。TIMPs可通過非共價(jià)鍵形式與MMPs催化區(qū)的Zn2+活性中心結(jié)合，抑制MMPs的活性。因此，體內(nèi)MMP/TIMP之間的相互平衡也影響著MMPs活性。
　　多種生長因子可調(diào)控MMPs的表達(dá)水平，其中TGF-β介導(dǎo)的信號通路對MMPs表達(dá)水平的調(diào)控發(fā)揮這重要作用，越來越引起人們的重視。
　　TGF-β可激活經(jīng)典的Smad信號通路和非Smad信號傳導(dǎo)通路，如促分裂原活化蛋白激酶(M

8、APK)信號通路，包括ERK1/2，JNK和p38，PI3K（磷酸肌醇激酶）/AKT1，2信號通路;NF-邙信號通路等。其中多項(xiàng)研究證明，TGF-β可通過MAPK及NF-κβ信號通路調(diào)控多種MMPs的表達(dá)水平，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。因此，通過抑制TGF-β介導(dǎo)的信號通路進(jìn)而抑制MMPs表達(dá)水平成為抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)之一。
　　目前，MMPs的抑制劑主要包括5類，分別是天然抑制劑（如TIMPs、endostati

9、n及angiostatin）、肽類MMPs抑制劑(如Batimastat、Marimastat和Salimastat)、非肽類MMPs抑制劑(AG3340、BAY12-9566、CGS27023A)、四環(huán)素類MMPs抑制劑（COL-3、多西環(huán)素）、雙膦酸鹽類MMPs抑制劑。此外，多糖類抗腫瘤藥物也表現(xiàn)出抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性，其中，肝素作為聚陰離子糖胺聚糖，臨床上主要應(yīng)用于抗凝，但近來研究發(fā)現(xiàn)，肝素表現(xiàn)出多種抗腫瘤活性，且其抗腫瘤活性與抑

10、制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的蛋白水解酶如MMPs、HPA密切相關(guān)。為降低肝素的抗凝作用，提高其抗腫瘤活性，人們通過化學(xué)修飾手段，制備得到了一系列具有抗腫瘤活性的肝素衍生物。其中，具有代表性的有M402。研究發(fā)現(xiàn)，M402可作用于腫瘤發(fā)展過程中的多個(gè)靶點(diǎn)，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過將肝素直接進(jìn)行高碘酸鈉氧化和硼氫化鈉還原后得到的肝素乙二醇斷裂衍生物(HP-sp)亦表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，并初步研究表明其抗腫瘤侵襲

11、和轉(zhuǎn)移活性與抑制HPA的活性相關(guān)。但發(fā)現(xiàn)其HPA的抑制活性與抗侵襲活性并不一致，考慮到ECM和BM的降解還與MMPs相關(guān)，TGF-β介導(dǎo)的MAPK信號通路（包括p38、Erk信號通路）、NF-κβ信號通路對MMPs的表達(dá)有重要調(diào)控作用，因此，本課題以HP、M402作為對照，通過考察它們對高侵襲和高轉(zhuǎn)移性HepG2細(xì)胞及大鼠原發(fā)性肝癌模型的作用，進(jìn)一步研究肝素及衍生物的抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性，并探討其抗腫瘤活性與MMPs活性、表達(dá)水平及TG

12、F-β介導(dǎo)的信號通路的關(guān)系。
　　本研究取得的主要成果有以下幾方面:
　　1.肝素衍生物的制備
　　通過對肝素及達(dá)肝素進(jìn)行高碘酸鈉氧化和硼氫化鈉還原，得到HP-sp和M402，并應(yīng)用高效分子排阻色譜法對其分子量進(jìn)行分子量測定，測得HP分子量為Mn=14037，Mw=17153，Mz=20697，HP-sp分子量為Mn=10697，Mw=13254，Mz=17261。該結(jié)果結(jié)合反應(yīng)機(jī)制表明制備過程中甚少發(fā)生糖苷鍵斷裂，主

13、要為開環(huán)反應(yīng)。
　　2.肝素及衍生物的體外抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移作用研究
　　2.1利用MTT法測定肝素及其衍生物對腫瘤細(xì)胞HepG2增殖的影響
　　采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測了肝素及衍生物對HepG2細(xì)胞增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)，采用低、中、高濃度的肝素及衍生物分別作用12h、24h、48h，肝素及衍生物對腫瘤細(xì)胞的增殖未表現(xiàn)出明顯的抑制作用。其中，在高濃度（500μg/mL）給藥處理后，HP抑制率為9.96％，H

14、P-sp抑制率為25.9％，M402抑制率為31.2％，均無明顯的細(xì)胞毒性，提示肝素及衍生物的抗腫瘤活性與抑制細(xì)胞增殖活性無關(guān)，將來若成藥，在腫瘤治療過程中與其他細(xì)胞毒性藥物的聯(lián)合應(yīng)用或可提高其抗腫瘤作用。
　　2.2利用劃痕法測定了肝素及衍生物對HepG2細(xì)胞遷移能力的影響
　　采用經(jīng)典的劃痕法測定了肝素及衍生物對HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，HP、HP-sp、M402對HepG2細(xì)胞遷移能力均有明顯的抑制作用，

15、且隨著藥物濃度的增高，給藥處理時(shí)間的增長，其抑制作用也明顯增強(qiáng)。其中，給藥24h后，中濃度(200μg/mL)的HP、HP-sp，高濃度（500μg/mL）的HP、HP-sp、M402與陰性對照組相比均可抑制HepG2細(xì)胞的遷移(P＜0.05);當(dāng)給藥36h后，中濃度及高濃度的HP、HP-sp、M402與陰性對照組相比均顯著抑制HepG2細(xì)胞的遷移(P＜0.05)。
　　2.3利用Transwell小室法測定了肝素及衍生物對Hep

16、G2細(xì)胞遷移能力的影響
　　采用Transwell小室法測定了肝素及衍生物對HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果表明，給藥24h后，與空白對照自相比，低、中、高作用濃度(100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)的HP、HP-sp、M402組穿過小室的細(xì)胞數(shù)目均顯著減少，且呈現(xiàn)劑量依賴性，并表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異(P＜0.05)。
　　2.4利用Matrigel法測定了肝素及衍生物對HepG2細(xì)胞侵襲能力的影

17、響
　　采用Matrigel膠，模擬ECM和BM環(huán)境，測定了肝素及衍生物對HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明，MMP抑制劑(MMPI)組、HP組、HP-sp組、M402組穿過Matrigel膠及Transwell小室上層的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且與空白對照組相比，HP-sp組穿過細(xì)胞數(shù)明顯下降(P＜0.05);HP、HP-sp、M402抑制HepG2穿過小室的能力強(qiáng)于MMPI組(P＜0.05)。
　　2.5利用Western

18、 Blot法測定了肝素及衍生物對TGF-β介導(dǎo)的信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的作用
　　通過Western Blot法測定了不同作用濃度(0、1、5、10、20μg/ml)的TGF-β對HepG2細(xì)胞中MMP-2、-9表達(dá)的影響。結(jié)果表明，TGF-β對HepG2細(xì)胞的MMP-2、-9分泌水平均有提高作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性;其中，當(dāng)作用濃度為10μg/ml時(shí)，TGF-β對MMP-2、-9表達(dá)水平均顯著提高。
　　通過Western

19、Blot法測定了HP、HP-sp、M402對TGF-β誘導(dǎo)的MMP-2、-9高表達(dá)的影響。用10μg/ml的TGF-β刺激后給予MMPI、HP、HP-sp、M402，結(jié)果表明，與TGF-β刺激組相比，HP、HP-sp、 M402均可抑制MMP-2、-9表達(dá)水平。其中，MMPI、HP、HP-sp、M402組MMP-2的的相對含量分別降低為89.8％、65.5％、66.9％、61.8％，與TGF-β刺激組相比，MMPI組MMP-2蛋白含量略

20、有下降，但未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05)，HP、HP-sp、M402組MMP-2蛋白含量均顯著下降(P＜0.05);MMP-9的相對含量分別降低為94.6％、61.9％、69.0％、69.5％，與TGF-β刺激組相比，MMPI組MMP-9含量略有下降，但未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05)，HP-sp、M402組MMP-9蛋白含量均明顯(P＜0.05)。
　　通過Western Blot法測定了HP、HP-sp、M402對TGF-β

21、介導(dǎo)的信號通路蛋白NF-κβ、p38、Erk表達(dá)的影響。結(jié)果表明，HP、HP-sp、M402均可抑制信號通路蛋白的表達(dá)，但MMPI的作用不明顯。與TGF-β刺激組相比，MMPI、HP、HP-sp、M402組NF-κβ的相對含量分別降低為87.6％、69.4％、59.8％、54.2％。與TGF-β刺激組相比，HP-sp組NF-κβ蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05);p38的相對含量分別降低為82.3％、49.2％、67.5％、55.8％

22、，與TGF-β刺激組相比，HP、HP-sp、M402組p38蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.05);Erk的相對含量分別降低為92.8％、77.7％、59.6％、55.9％，雖也表現(xiàn)出抑制作用，但與TGF-β刺激組相比均未表現(xiàn)出顯著性差異。
　　3.肝素及衍生物的體內(nèi)抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移作用研究
　　通過建立高轉(zhuǎn)移及高侵襲性的大鼠肝癌模型，考察了HP、HP-sp、M402在體內(nèi)的抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性及作用機(jī)制。與造模組相比，HP

23、、HP-sp、M402在20mg/kg劑量下均能降低肝重/體重比值（肝重/體重比值是原發(fā)性腫瘤質(zhì)量指數(shù)的指標(biāo)之一，比值越大，腫瘤組織的數(shù)量及體積越大。），減少小鼠肝部結(jié)節(jié)數(shù)，減輕由原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移引起的肺部病變情況。
　　大鼠肝臟HE染色結(jié)果表明，與造模組相比，Hp、HP-sp、M402能有效抑制肝臟細(xì)胞壞死，減少肝竇淤血現(xiàn)象，減少細(xì)胞及纖維組織增生，改善肝臟病變狀況。大鼠肝臟免疫組化染色結(jié)果表明，造模組MMP-2、-9，特別是MM

24、P-9表達(dá)水平明顯升高，且大量集中在血管周圍;與造模組相比，HP組、HP-sp組及M402組MMP-2、-9表達(dá)量明顯降低，證明肝素及衍生物均可抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，且與其降低MMP-2、-9表達(dá)水平密切相關(guān)。
　　4.課題總結(jié)與創(chuàng)新
　　本課題從細(xì)胞水平及動物水平上研究了HP、HP-sp、M402的抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性及與MMPs表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果表明，(1) HP、HP-sp、M402無明顯的細(xì)胞增殖抑制作用;(2)

25、 HP、HP-sp、M402能顯著抑制HepG2細(xì)胞遷移能力，且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性;(3) HP、HP-sp、M402能顯著抑制HepG2細(xì)胞的侵襲，比MMPI抑制作用更強(qiáng);(4) HP、HP-sp、M402均可明顯降低HepG2細(xì)胞的MMP-2、-9的表達(dá)水平;(5)HP、HP-sp、M402可顯著降低TGF-β/MAPK/p38/MMPs信號通路中p38蛋白表達(dá)水平;HP-sp可顯著降低TGF-β/NF-κβ/MPs信號中NF-κ

26、β蛋白表達(dá)水平。(6) HP、HP-sp、M402均可減少原發(fā)性肝癌大鼠模型中肝部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和肺轉(zhuǎn)移;HP、HP-sp、M402均可顯著降低原發(fā)性肝癌大鼠肝部MMP-2，MMP-9表達(dá)水平。
　　總之，在本實(shí)驗(yàn)研究中，以HP和M402為對照，選取高侵襲和高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株HepG2細(xì)胞和高侵襲高轉(zhuǎn)移的原發(fā)性肝癌大鼠模型，研究了非抗凝活性的肝素衍生物HP-sp抗腫瘤活性與MMPs活性和表達(dá)水平關(guān)系及作用機(jī)制，結(jié)果表明HP-sp無細(xì)胞毒作