E2F1對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文E2F1對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控RegulationofNeuronalApoptosisbyE2F1專業(yè)名稱：申請人姓名：指導(dǎo)老師：答辯委員會主席：答辯委員成員：專；娩藥理學(xué)袁忠民黎明濤教授￡闌中山大學(xué)J’‘州2005年5月V7BB745E2F!對辯燧元鞘f麴髑捧但是，我們在研究細(xì)胞周期蛋白調(diào)控小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，卻發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元在低鉀處理下轉(zhuǎn)錄因子E2FI并沒有被誘導(dǎo)表達，而是隨凋亡刺激時間延長被降解，進一步研究證實E2

2、F1具有促存活作用，其生物學(xué)功能和在胞內(nèi)的生物學(xué)行為與現(xiàn)有的報道不符。實驗方法：1培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)：取出生7—9天的SpragueDawley大鼠解剖后取小腦，經(jīng)胰酶消化后按每毫升I5X106個細(xì)胞種植于專用培養(yǎng)板。體外培養(yǎng)7天分化成熟。(本論文中除專門標(biāo)注，全部使用大鼠小腦顆粒神經(jīng)元用于各個實驗)。2凋亡模型建立：分化成熟的CGNs，去掉條件培養(yǎng)基換成含25raMKCI的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，這時cGNs繼續(xù)存活(通常將

3、這種處理稱為高鉀或者25K處理)。當(dāng)培養(yǎng)基換成僅含5raMKCI的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(通常將這種處理稱為低鉀或者5K處理)，CGNs逐漸發(fā)生凋亡，表現(xiàn)出明顯的凋亡特征，如胞體皺縮、核固縮、DNALadder、凋亡小體等。這是國際上公認(rèn)的最經(jīng)典的凋亡模型之一。3Hoeehst33258染色：Hoechst33258是一種DNA熒光染料，可以插入并結(jié)合于DNA鏈的A—T區(qū)，紫外光激發(fā)后，可釋放藍色熒光。正常神經(jīng)元核內(nèi)DNA分布相對均勻，核無

4、固縮，在視野中呈現(xiàn)體積較大的淺染核形態(tài)，而凋亡中的神經(jīng)元其核內(nèi)DNA濃聚，出現(xiàn)不同程度的固縮，故呈現(xiàn)體積明顯縮小的深染核形態(tài)。4腺病毒構(gòu)建：使用Hindm，EeoRV雙酶切pRcFlagE2F1質(zhì)粒(來自法國DidierMonte教授)獲得人的E2FI基因編碼區(qū)序列片段，T4連接酶定向插入pshuttle—CMV。PineI線性化后與Adeasy一1共轉(zhuǎn)化BJ5183細(xì)菌進行同源重組，得到AdFlag—E2F1腺病毒前體質(zhì)粒。經(jīng)PacI