嗜水氣單胞菌主要粘附素基因序列及其重組基因表達產(chǎn)物功能分析.pdf

1、為了深入探討不同嗜水氣單胞菌(Ah)之間主要粘附素基因在序列方面的差異以及主要粘附素的功能,了解主要粘附素在菌體侵入宿主和介導宿主產(chǎn)生免疫過程可能扮演的角色,對6株Ah菌主要粘附素基因進行克隆、測序,同時對Ah菌ZN1株主要粘附素重組基因的表達條件進行了優(yōu)化,并對表達產(chǎn)物的部分生物學功能進行了分析,獲得如下結果。
　　 核苷酸和氨基酸序列分析結果表明:6株Ah菌主要粘附素基因核苷酸和氨基酸同源率范圍分別為35.6％～99.6％和

2、34.2％～99.5％;相同來源且相同血清型的菌株BL①和BL④之間,主要粘附素基因核苷酸同源性最高為99.6％,對應氨基酸的同源性為84.6％;不同來源且不同血清型的菌株BL①和TPS-30之間主要粘附素基因核苷酸同源性為98.1％,對應氨基酸的同源性僅42.3％;此外,菌株ZN1(血清型為0:10501、分離自歐洲鰻鱺)的主要粘附素氨基酸序列與其他菌株差異較大同源率僅為34.2％～63.6％。結果提示嗜水氣單胞菌菌株間主要粘附素基因

3、核苷酸和氨基酸同源性與菌株來源和血清型沒有嚴謹?shù)南嚓P性,而呈現(xiàn)出一定的多樣性。
　　 主要粘附素基因重組表達條件優(yōu)化結果表明:嗜水氣單胞菌ZN1株主要粘附素基因(Mah)重組菌.Ecoli BL21(命名為ZAPB)在誘導前增菌4hrs、5hrs的表達效果優(yōu)于增菌2hrs、3hrs;在添加不同誘導物IPTG濃度(0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L)條件下,表達效果相近;誘導表達2hrs

4、、3hrs的效果優(yōu)于4hrs和5hrs;在27℃條件下,誘導表達的效果優(yōu)于30℃、33℃和37℃;此外,增加通氧量、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值(分別為6.0和8.0)和低溫延時表達(16℃誘導8h)都不能改善表達效果,且表達產(chǎn)物也主要以包涵體的形式存在。結果表明ZAPB最佳表達條件為:搖床轉速200r/min,誘導前預增菌4hrs,菌液濃度在OD600=0.6～0.8之間,誘導物IPTG濃度為0.5mmol/L,誘導溫度27℃,誘導表達3hrs。

5、
　　 主要粘附素基因重組表達產(chǎn)物免疫學特性與功能分析的結果表明:(1)交叉EIASA結果顯示,兔抗基因供體菌ZN1株的天然外膜蛋白(ZN1-OMP)血清對表達產(chǎn)物Mah-TrxA(硫氧還蛋白與主要粘附素形成的融合蛋白)及ZN1-OMP的反應滴度分別為1∶3200和1∶12800;兔抗Mah-TrxA血清對Mah-TrxA及ZN1-OMP的反應滴度分別為1∶12800和1∶1600,說明表達產(chǎn)物和天然外膜蛋白具有類似的免疫學特性

6、。(2)粘附試驗顯示,魚源Ah菌ZN1株和BL①株(血清型O:Ah10501)、TPS-30株和Ah9805株(血清型0:9)及CQ-3株(血清型O:CQ-1)對鯉魚上皮瘤細胞(EPC)的相對粘附率高達97％以上;非魚源Ah菌ATCC7966株(血清型O:1)對EPC的相對粘附率為78.5％。(3)粘附抑制和阻斷試驗顯示,EPC經(jīng)Mah-TrxA預孵育后,與不同Ah菌株進行粘附試驗,EPC的平均粘附菌數(shù)僅為0.3～3.9(＜10);供試

7、的不同Ah菌株經(jīng)兔抗Mah-TrxA血清預孵育后,與EPC進行粘附試驗,EPC的平均粘附菌數(shù)也僅為0.3～3.7(＜10)。結果提示Mah-TrxA對不同Ah菌株有交叉抑制的作用,抗原競爭性抑制試驗和抗體阻斷試驗均能顯著減少不同Ah菌株對EPC的粘附作用,從正反兩個方面都提示克隆、表達的Mah-TrxA確為ZN1菌株的主要粘附素:同時還證實借助基因工程技術以融合蛋白形式表達的Mah-TrxA與野生菌株ZN1表達的主要粘附素具有類似的生物

8、學活性。
　　 綜上所述,本研究課題分析比較了6株不同Ah菌主要粘附素基因的核苷酸和氨基酸的同源性,闡明Ah主要粘附素基因同源性與菌株來源和血清型沒有嚴謹?shù)南嚓P性;驗證了Mah-TrxA對魚類細胞的粘附功能,證實了Mah是ZN1菌株的主要粘附素基因;交叉抑制試驗證明Mah-TrxA融合蛋白能夠抑制不同來源和血清型Ah菌株對EPC的粘附,結果提示不同Ah菌株的粘附位點具有一定的保守性。這一發(fā)現(xiàn)也許能為魚類嗜水氣單胞菌疾病的防控提供