腸道機(jī)械屏障損傷在重癥急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用及不同因素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)觀察重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)模型大鼠腸組織中緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和分泌型磷脂酶A2(secretedphospholipaseA2，sPLA2)表達(dá)的變化規(guī)律，來(lái)探討重癥急性胰腺炎時(shí)，因上皮細(xì)胞凋亡和緊密連接斷裂引起腸道機(jī)械屏障損傷的發(fā)生發(fā)展與分泌型磷脂酶A2、緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1的關(guān)系，分析肌球蛋白輕鏈激酶(myosi

2、n light chain kinase，MLCK)對(duì)緊密連接蛋白的調(diào)控通路在腸黏膜機(jī)械屏障中的作用，從而進(jìn)一步探究重癥急性胰腺炎時(shí)腸道屏障功能損傷的發(fā)病機(jī)理，探討中醫(yī)通里攻下理論在重癥急性胰腺炎時(shí)腸道屏障功能損傷發(fā)病機(jī)制中的作用，同時(shí)觀察祖國(guó)傳統(tǒng)中藥清胰湯(Qingyitang)、臨床常規(guī)抗炎藥物地塞米松(Dexamethasone)、MLCK抑制劑ML-7和樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cells，DC)對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡、緊密連

3、接結(jié)構(gòu)變化、炎癥因子表達(dá)水平的影響，探討中藥清胰湯對(duì)重癥急性胰腺炎相關(guān)腸道機(jī)械屏障損傷的保護(hù)作用，為臨床工作中有效提高重癥急性胰腺炎及其腸道損傷的治療效果提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:采用經(jīng)十二指腸大乳頭開(kāi)口處沿膽胰管內(nèi)逆行注射1.5％去氧膽酸鈉模擬膽源性胰腺炎的方法建立SAP大鼠模型。128只體質(zhì)量為180～220g健康雄性SPF級(jí)(Spraghe-Dawley，SD)大鼠，隨機(jī)分為4組:假手術(shù)(sha

4、m operation，SO)組、重癥急性胰腺炎(SAP)模型組、清胰湯(Qingyitang，QYT)干預(yù)組、地塞米松(Dexamethasone，DEX)干預(yù)組。其中，SO組僅在打開(kāi)腹腔后輕翻胰腺1～2次后關(guān)腹，SAP模型組采用去氧膽酸鈉膽胰管內(nèi)逆行注射建立SAP大鼠模型，QYT干預(yù)組在制備SAP大鼠模型前0.5h、后6h和12h給予中藥制劑清胰湯灌胃，DEX干預(yù)組在制備SAP大鼠模型后立即、后6h和12h經(jīng)尾靜脈注射地塞米松進(jìn)行干

5、預(yù)，地塞米松給藥劑量:10mg/kg，濃度:5mg/ml。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模后2h、6h、12h、24h每一時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選取8只大鼠，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，留取血液和組織標(biāo)本，觀察胰腺和腸組織病理改變，上皮細(xì)胞間緊密連接變化情況，測(cè)定血清淀粉酶、內(nèi)毒素、TNF-α的含量。在造模24h后應(yīng)用TUNEL-FITC法檢測(cè)大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Real-time PCR法檢測(cè)大鼠腸黏膜緊密連接蛋白Occludin-1 mRNA

6、、ZO-1mRNA和sPLA2mRNA基因表達(dá)。應(yīng)用Westernblot法檢測(cè)腸組織中緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和sPLA2的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二:分為動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分。動(dòng)物模型部分，48只健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為:假手術(shù)組、模型組、清胰湯干預(yù)組和肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑ML-7（劑量:1mg/kg，濃度:1mg/ml）干預(yù)組。各組大鼠造模24 h后麻醉，留取血液和組織標(biāo)本，應(yīng)用ELISA法（酶聯(lián)免

7、疫吸附測(cè)定法）檢測(cè)大鼠血清中內(nèi)毒素、TNF-α等含量，應(yīng)用免疫熒光法定位檢測(cè)腸黏膜緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達(dá)，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達(dá)水平。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分，選用人腸黏膜上皮細(xì)胞株Caco2，以100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的不同濃度脂多糖(LPS)刺激腸

8、黏膜上皮細(xì)胞，制備腸黏膜上細(xì)胞損傷模型，并于刺激后48h檢測(cè)炎癥因子表達(dá)水平，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達(dá)水平，并最終選取1μg/ml LPS刺激48h后的上皮細(xì)胞為損傷模型，設(shè)立空白對(duì)照組，采用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)腸黏膜上皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)觀察中藥單體大黃素(40μM)和肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑ML-7(10μM)的干預(yù)作用。

9、r>　　實(shí)驗(yàn)三:采用LPS刺激人腸黏膜上皮Caco2細(xì)胞株，建立腸黏膜上皮細(xì)胞損傷模型，分為空白對(duì)照組、LPS刺激組、10％樹(shù)突細(xì)胞干預(yù)組（樹(shù)突細(xì)胞與Caco2細(xì)胞共培養(yǎng)比值為1∶10）、5％樹(shù)突細(xì)胞干預(yù)組（樹(shù)突細(xì)胞與Caco2細(xì)胞共培養(yǎng)比值為1∶20）、2.5％樹(shù)突細(xì)胞干預(yù)組（樹(shù)突細(xì)胞與Caco2細(xì)胞共培養(yǎng)比值為1∶40）。造模48h后，應(yīng)用液相芯片法檢測(cè)炎癥因子表達(dá)水平，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白O

10、ccludin-1、ZO-1和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達(dá)水平，采用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)腸黏膜上皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化，分析樹(shù)突細(xì)胞的干預(yù)作用。
　　結(jié)果:
　　(1)對(duì)比假手術(shù)組，SAP模型組大鼠血清內(nèi)毒素、TNF-α和淀粉酶含量、腸組織中sPLA2、 MLCK蛋白含量均明顯增高，腸組織中緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯減少，胰、腸組織出現(xiàn)明顯損傷，腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接間隙增寬，腸黏膜上皮細(xì)胞凋

11、亡量升高(P＜0.01)。對(duì)比SAP模型組，清胰湯、地塞米松、ML-7三組藥物干預(yù)后的大鼠血清內(nèi)毒素、TNF-α、淀粉酶含量、腸組織中sPLA2、 MLCK蛋白含量均明顯減少，腸組織中緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯增高，胰、腸病理?yè)p傷較輕，腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)損傷減輕，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡相對(duì)減少，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)與對(duì)照組相比，LPS刺激組Caco2細(xì)胞MLCK含量明顯增

12、高(P＜0.05)，細(xì)胞間緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯減少(P＜0.05)，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損傷明顯，以LPS刺激48h后的腸黏膜上皮細(xì)胞損傷最為顯著。與LPS刺激組相比，ML-7干預(yù)組Caco2細(xì)胞MLCK含量明顯減少（P＜0.05），細(xì)胞間緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯增加（P＜0.05）;大黃素干預(yù)組炎癥因子IL-1β、IFN-γ表達(dá)明顯減少，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損傷減輕，但緊密連結(jié)蛋白含量較LPS刺

13、激組并無(wú)明顯改變。與LPS刺激組相比，10％樹(shù)突細(xì)胞干預(yù)組Caco2細(xì)胞間緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯增加(P＜0.05)，MLCK含量明顯減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)在膽胰管內(nèi)逆行注射去氧膽酸鈉溶液制備膽源性重癥急性胰腺炎大鼠腸道屏障損傷模型穩(wěn)定，模型組大鼠血清內(nèi)毒素、TNF-α等炎癥因子含量在短時(shí)間內(nèi)(2h)顯著升高，胰腺和腸組織發(fā)生明顯損傷。
　　(2)SAP時(shí)，腸組織中s

14、PLA2表達(dá)增高，促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡，在腸黏膜機(jī)械屏障損傷中起重要作用。
　　(3)SAP時(shí)，高表達(dá)的MLCK下調(diào)緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1的表達(dá)，導(dǎo)致緊密連接間隙增寬，在腸黏膜機(jī)械屏障損傷中均起重要作用。
　　(4)地塞米松可以抑制血清內(nèi)毒素、TNF-α的過(guò)量表達(dá)。ML-7能抑制MLCK的過(guò)度表達(dá)。清胰湯可以通過(guò)促進(jìn)腸蠕動(dòng)、降低腸道通透性、減少腸道內(nèi)細(xì)菌移位的作用，防治SAP相關(guān)腸道屏障損傷，其可以和西