小鼠不同免疫抑制劑作用下肺隱球菌感染的炎癥改變和對(duì)唑類藥物療效的差異性研究.pdf

1、【目的】
　　利用滴鼻法建立小鼠肺隱球菌感染模型，探討不同免疫抑制劑引起小鼠發(fā)生感染的可行性，為進(jìn)一步研究臨床、分子生物學(xué)、病理改變以及治療的對(duì)照研究奠定基礎(chǔ)；比較不同免疫抑制狀態(tài)下小鼠感染隱球菌后的生存期、病死率及疾病終末期時(shí)的感染程度的區(qū)別，以及其病理學(xué)差異；探討氟康唑、伏立康唑分別治療不同免疫狀態(tài)的隱球菌感染的療效。
　　【材料與方法】
　　健康雌性BALB/c小鼠，體重20±2g。隨機(jī)分為3組，即甲強(qiáng)龍（MP）

2、組、環(huán)磷酰胺（CTX）組、對(duì)照（IC）組，每組20只。MP組為注射甲潑尼龍后接種新生隱球菌懸浮液，CTX組為注射環(huán)磷酰胺后接種新生隱球菌懸浮液，IC組為注射生理鹽水后接種新生隱球菌懸浮液。具體的免疫抑制方法為：MP組于接種前3日每日腹腔注射200mg/kg甲潑尼龍，接種后每日1次維持免疫抑制狀態(tài)；CTX組于接種前3日每日腹腔注射200mg/kg環(huán)磷酰胺，接種后每日1次維持免疫抑制狀態(tài)；IC組相同時(shí)間腹腔注射等量的生理鹽水。所有試驗(yàn)小鼠于

3、接種前3天起每日應(yīng)用抗生素預(yù)防細(xì)菌感染，予頭孢他定150mg/kg腹腔注射，每日1次。接種當(dāng)天每組隨機(jī)選取5只小鼠眼眶取血檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)。第4日經(jīng)滴鼻法向小鼠鼻內(nèi)接種配置好的新生隱球菌40μl（濃度1.0×108cfu/ml）懸浮液。接種后每日連續(xù)觀察并記錄觀察生存期，在疾病的終末期（CTX組為接種后第7天，MP組及對(duì)照組為接種后第18天）處死后取肺、腦組織勻漿行真菌培養(yǎng)，并通過(guò)比較菌落數(shù)比較感染程度，同時(shí)肺組織行病理檢查（HE、PAS

4、、六胺銀染色）。收集外周血清用于腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素-10（IL-10）的測(cè)定。
　　將環(huán)磷酰胺和甲強(qiáng)龍免疫抑制小鼠再分為6組：即環(huán)磷酰胺（CTX）組，環(huán)磷酰胺-氟康唑（CTX-FZ）組，環(huán)磷酰胺-伏立康唑（CTX-VZ）組，甲強(qiáng)龍（MP）組，甲強(qiáng)龍-氟康唑（MP-FZ）組，甲強(qiáng)龍-伏立康唑（MP-VZ）組，每組20只。免疫抑制和滴鼻接種法同上，CTX-FZ組和MP-FZ組于接種后24小時(shí)腹腔注射氟康唑注射液（10m

5、g/kg/qd），CTX-VZ組和MP-VZ組接種后24小時(shí)予伏立康唑灌胃治療（40mg/kg/qd），CTX組與MP組未予治療。每組隨機(jī)挑選10只小鼠用于觀察生存期，剩余的10只CTX組、CTX-FZ組、CTX-VZ組在接種后第7天，MP組、MP-VZ組、MP-FZ組于接種后第18天處死后取肺、腦組織勻漿行真菌培養(yǎng)，并通過(guò)比較菌落數(shù)比較感染程度，同時(shí)肺組織行病理檢查（HE、PAS及六胺銀染色）。
　　【結(jié)果】
　　一、小鼠

6、不同免疫狀態(tài)模型構(gòu)建情況
　?。ㄒ唬┌准?xì)胞數(shù)目改變：
　　CTX組免疫抑制前后白細(xì)胞計(jì)數(shù)均值分別為7.65×109/L，5.00×109/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。MP組免疫抑制前后分別為7.74×109/L，5.38×109/L，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.003）。IC組為分別為7.97×109/L，7.66×109/L，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.518）。
　?。ǘ┬∈蠓坞[球菌病模型構(gòu)建情況：
　

7、　CTX組接種成功率為100％（11/11），模型建立成功率為100%（11/11）。MP組接種成功率為100%（12/12），模型建立成功率為100%（12/12）。IC組接種成功率為100%（9/9），模型建立成功率為66.67%（6/9）。
　　（三）小鼠肺組織勻漿培養(yǎng)情況：
　　CTX組中肺組織勻漿真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率100%（11/11），MP組中真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率100%（12/12），IC組真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率100%（9/9

8、）。
　?。ㄋ模┓谓M織病理學(xué)檢查結(jié)果：
　　CTX組和MP組小鼠鏡下表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)破壞、間質(zhì)充血及出血性壞死，肺部病變彌漫，真菌負(fù)荷大。對(duì)照組小鼠肺部病變局限，真菌負(fù)荷較少。
　　二、不同免疫狀態(tài)感染隱球菌后炎癥改變情況
　　（一）生存時(shí)間：
　　CTX組、MP組接種后生存時(shí)間分別為6.80±1.32d、17.30±2.41d，IC組小鼠未發(fā)生死亡。三組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020＜0.05）。且M

9、P組小鼠生存期明顯長(zhǎng)于環(huán)磷酰胺組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000＜0.05）。
　　（二）小鼠肺組織培養(yǎng)情況：
　　CTX組肺勻漿平板菌落計(jì)數(shù)均值為8.6±0.43log10，MP組為8.1±0.58log10，IC組為2.9±0.39log10，三組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012＜0.05），CTX組和MP組菌落數(shù)明顯多于IC組，而MP組與CTX組經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。ㄈ┬∈箅[球菌病肺外器官受

10、累及培養(yǎng)情況：
　　CTX組中10例（100%）小鼠腦組織真菌培養(yǎng)陽(yáng)性，MP組中10例（100%）真菌培養(yǎng)陽(yáng)性，IC組中均未培養(yǎng)出隱球菌，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。CTX組和MP組小鼠腦組織真菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。ㄋ模┬∈笱猅NF-α和IL-10相對(duì)定量表達(dá)水平的比較：
　　（1）三組研究對(duì)象的外周血TNF-α相對(duì)定量表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022）。CTX組較IC組和MP組

11、明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.011和0.026）。MP組的TNF-α相對(duì)定量表達(dá)水平與IC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）三組研究對(duì)象的外周血IL-10相對(duì)定量表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。CTX組和MP組均高于IC組。
　?。ㄎ澹?shí)驗(yàn)組小鼠病理組織學(xué)對(duì)比分析：
　　CTX組表現(xiàn)為肺泡破壞融合，嚴(yán)重程度高于MP組和IC組，三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CTX組及MP組小鼠的肺部孢子數(shù)明顯高于IC組，三組差異具有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CTX組與MP組的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三、氟康唑、伏立康唑分別治療不同免疫狀態(tài)情況
　?。ㄒ唬┙M間生存時(shí)間比較：
　　CTX組、CTX-FZ組、CTX-VZ組接種后生存時(shí)間分別為6.80±1.32d，7.8±0.84d，9.6±2.07d，三組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。其中CTX-VZ組小鼠生存期明顯長(zhǎng)于CTX組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。但CTX-FZ組和CTX組無(wú)統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)差異。MP組、MP-FZ組、MP-VZ組接種后生存時(shí)間分別為17.3±2.41d，17.5±2.08d，19.5±2.38d，三組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.112）。（二）組間病理組織學(xué)對(duì)比：
　　CTX組、CTX-FZ組、CTX-VZ組的肺泡直徑分別為3.46±0.47mm，3.32±0.41mm，3.16±0.25mm。三組研究對(duì)象的肺泡破壞程度比較，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.491）。MP組、MP-FZ組、MP-

14、VZ組的肺泡直徑為2.72±0.25mm，2.82±0.16mm，2.66±0.11mm。三組研究對(duì)象的肺泡破壞程度比較，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.417）。
　　（三）肺部真菌負(fù)荷比較：
　　CTX組、CTX-FZ組、CTX-VZ組三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039）。且CTX-VZ組小鼠的肺部真菌負(fù)荷較CTX組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）。MP組、MP-FZ組、MP-VZ組的肺部真菌負(fù)荷比較，