右美托咪定對機(jī)械通氣肺損傷大鼠細(xì)胞凋亡及JNK信號通路的影響.pdf

1、背景與目的：
　　實施全身麻醉以及搶救危重癥患者時，機(jī)械通氣是一種不可或缺的呼吸支持手段。然而，機(jī)械通氣是一把雙刃劍，在提供氧供的同時，其本身又可以作為一種損傷因素來誘發(fā)機(jī)械通氣肺損傷（VILI，ventilator-induced lung injury）。臨床及動物實驗研究表明，在接受機(jī)械通氣前，無論肺功能是否受損，使用呼吸機(jī)行大潮氣量的機(jī)械通氣都會導(dǎo)致不同程度的肺損傷。
　　VILI的發(fā)生原因有很多，其是各種損傷因素相

2、互作用的結(jié)果，具體機(jī)制尚不完全清楚。VILI包含機(jī)械傷及生物傷，其中生物傷，即肺部急性炎性損傷，是目前的研究熱點。在多種損傷因素（諸如缺血、缺氧、氧化應(yīng)激及炎癥等）所致的肺損傷發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡的作用日益得到重視。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是 VILI的發(fā)生機(jī)制之一，其中，c-Jun氨基末端激酶（JNK，c-Jun N-terminal kinase）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（MAPKs家族中一條重要的通路）具有介導(dǎo)炎癥反

3、應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的作用，但是，它是否參與到過度機(jī)械通氣誘導(dǎo)的肺組織細(xì)胞凋亡，與之相關(guān)的國內(nèi)外報道還較少。
　　右美托咪定（Dex，dexmedetomidine），一種新型的、高選擇性的α2-腎上腺能受體激動劑，兼有抑制交感神經(jīng)、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜以及抑制兒茶酚胺釋放等作用，且有呼吸抑制作用輕微的優(yōu)勢。Dex可對心臟、腦以及腎臟等器官產(chǎn)生保護(hù)作用，且能夠明顯的減輕VILI時肺部的炎癥反應(yīng)。目前的研究也已證實，Dex具有抗組織損傷以及抗細(xì)胞凋

4、亡的作用，但對VILI時的細(xì)胞凋亡是否有效及其具體機(jī)制（如對細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活）尚未明了。
　　本研究擬采用大潮氣量機(jī)械通氣的方法來復(fù)制大鼠VILI的模型，并在進(jìn)行大潮氣量機(jī)械通氣前干預(yù)使用不同劑量的Dex，觀察Dex對VILI大鼠肺組織損傷、細(xì)胞凋亡以及JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的影響，進(jìn)一步探討Dex對VILI大鼠的肺保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　材料與方法：
　　按照隨機(jī)數(shù)字表法將48只健康、雄性的SD大鼠均

5、分為6組（n=8）：C組，N組，H組，H+D1組，H+D2組，H+D2+Y組。C組為保留自主呼吸組；N組為常規(guī)潮氣量通氣，VT8 ml/kg，RR70次/分；H組、H+D1組、H+D2組及H+D2+Y組均為大潮氣量通氣，VT20 ml/kg，RR50次/分。其中，在對大鼠行機(jī)械通氣前，H+D1組和H+D2組分別經(jīng)靜脈推注（>10 min推注完畢）2.5μg/kg和5μg/kg的右美托咪定稀釋液，H+D2+Y組在靜脈推注右美托咪定前30

6、min靜脈推注0.1 mg/kg的育亨賓稀釋液。C組、N組和H組靜脈推注同等量的生理鹽水。按上述各組設(shè)置調(diào)整呼吸參數(shù)，F(xiàn)iO2=21％（吸入氣體為室內(nèi)空氣），吸呼比為1:2，通氣時間為4 h。機(jī)械通氣結(jié)束后，腹主動脈放血至大鼠死亡。取肺組織：右肺上葉，液氮冷凍30 min后置于-80℃冰箱保存，待做Western blot測定肺組織中JNK與p-JNK蛋白質(zhì)含量；右肺中葉石蠟包埋后切片待做病理學(xué)檢測、免疫組化和TUNEL；右肺下葉，稱量

7、濕重后于60℃恒溫箱中放置72 h以上至恒重，稱量干重，測定濕/干重比值。灌洗左肺，回收BALF，離心取適量上清液分裝密封，置-80℃冰箱凍存，待測定BALF中總蛋白的含量。
　　結(jié)果：
　　1肺組織濕/干重（W/D）比值變化
　　與C組相比，N組大鼠肺組織W/D差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而H組大鼠肺組織W/D明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H組相比，H+D1組大鼠肺組織W/D差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P

8、>0.05），而H+D2組大鼠肺組織W/D明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H+D2組相比，H+D2+Y組大鼠肺組織W/D明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2 BALF中總蛋白含量的變化
　　與C組相比，N組大鼠BALF中總蛋白的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而H組大鼠BALF中總蛋白的濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H組相比，H+D1組大鼠BALF中總蛋白的濃度差異無統(tǒng)

9、計學(xué)意義（P>0.05），而H+D2組大鼠BALF中總蛋白的濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H+D2組相比，H+D2+Y組大鼠BALF中總蛋白的濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3肺組織病理學(xué)的變化
　　C組大鼠肺組織未見明顯的病理學(xué)改變，肺組織結(jié)構(gòu)正常；N組大鼠肺組織有較輕微的病理學(xué)改變，僅有少量的炎癥細(xì)胞浸潤；與 C組大鼠相比，H組大鼠肺組織可見較嚴(yán)重的病理學(xué)改變，肺組織結(jié)構(gòu)較紊亂，

10、肺泡壁斷裂及增厚，部分肺泡腔內(nèi)有較多淡紅色滲出液、出血及炎性滲液積聚，肺泡間有大量的炎癥細(xì)胞浸潤；H+D1組大鼠肺組織病理學(xué)改變與H組相似；與H組大鼠相比，H+D2組大鼠肺組織病理學(xué)改變明顯減輕，肺泡腔內(nèi)漿液和炎癥細(xì)胞明顯減少；與H+D2組大鼠相比，H+D2+Y組大鼠肺組織病理學(xué)改變加重，肺泡壁斷裂及增厚，肺泡間的漿液和炎癥細(xì)胞增多。
　　4肺組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL法）
　　C組肺組織內(nèi)未見凋亡細(xì)胞；N組肺組織內(nèi)可見極

11、少量的陽性細(xì)胞；H組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加；H+ D1組肺組織內(nèi)凋亡細(xì)胞情況與H組相似；H+D2組肺組織內(nèi)陽性細(xì)胞較H組明顯減少；H+D2+Y組肺組織內(nèi)陽性細(xì)胞較H+D2組明顯增多。其中，陽性細(xì)胞多為肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及小氣道上皮細(xì)胞，部分可見于浸潤的炎性細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。肺組織 AI變化：H組大鼠肺組織AI較C組和N組顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H組相比，H+D1組大鼠肺組織AI差異無統(tǒng)計學(xué)意義

12、（P>0.05），而H+D2組大鼠肺組織AI明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H+D2組相比，H+D2+Y組大鼠肺組織AI明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　5肺組織內(nèi)p-JNK蛋白表達(dá)分布情況（免疫組化法）
　　C組和N組肺組織內(nèi)可見個別的陽性細(xì)胞；H組肺組織內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，蛋白表達(dá)明顯增多；H+D1組肺組織內(nèi)蛋白表達(dá)情況與H組相似；H+D2組肺組織內(nèi)蛋白表達(dá)較H組明顯減少；H+D2+Y組

13、肺組織內(nèi)蛋白表達(dá)較H+ D2組明顯增多。其中，陽性細(xì)胞多分布于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞，部分見于浸潤的炎性細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞。肺組織中 p-JNK蛋白表達(dá)水平（a*b積分表示）變化：與C組相比，N組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而H組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H組相比，H+D1組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義

14、（P>0.05），而H+D2組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H+D2組相比，H+D2+Y組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?？梢?，肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)量及分布情況與肺組織內(nèi)凋亡細(xì)胞情況大體上一致。
　　6肺組織內(nèi)JNK及p-JNK蛋白表達(dá)情況（Western blot法）
　　各組大鼠間肺組織中JNK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

15、P>0.05）。
　　與C組相比，N組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而H組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H組相比，H+D1組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而H+D2組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與H+D2組相比，H+D2+Y組大鼠肺組織中p-JNK蛋白表達(dá)量明顯升高