金雀異黃素對(duì)高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬和炎癥損傷的干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、目的:隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的改變，糖尿病發(fā)病率逐年升高，預(yù)計(jì)到2030年全球糖尿病患者將增加至3.66億。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，隨著糖尿病發(fā)病率的升高，糖尿病腎病患者也越來越多，目前已成為我國(guó)導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因之一，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，嚴(yán)重影響著人們健康。進(jìn)一步揭示糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，探索防止或

2、延緩病變進(jìn)展的有效措施是國(guó)內(nèi)外腎臟病學(xué)界熱切關(guān)注的重要課題。
　　糖尿病腎病的病因復(fù)雜，涉及多種機(jī)制，包括糖代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激與炎癥損傷、細(xì)胞因子和遺傳背景等。糖尿病腎病的主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿和進(jìn)行性腎功能減退;其腎臟病理表現(xiàn)主要為腎小球系膜基質(zhì)積聚、基底膜(GBM)增厚引起結(jié)節(jié)狀或彌漫性腎小球硬化以及腎小管-間質(zhì)纖維化。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，足細(xì)胞損傷是蛋白尿的病理基礎(chǔ)，是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過程

3、中的重要環(huán)節(jié)，但迄今其發(fā)生機(jī)制尚未明確。
　　自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器等物質(zhì)的降解過程，是存在于真核生物細(xì)胞中的一種高度保守的保護(hù)性機(jī)制，對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、維持細(xì)胞的存活具有重要意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞具有高水平的基礎(chǔ)自噬活性，在高糖環(huán)境中，細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)生改變，使細(xì)胞自噬功能受損，不能對(duì)各種應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)，且加重細(xì)胞器功能的紊亂和結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。足細(xì)胞自噬參與糖尿病腎病發(fā)生的機(jī)制研究已成為該領(lǐng)域的

4、熱點(diǎn)課題。
　　此外，長(zhǎng)期微炎癥狀態(tài)是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，不同途徑激活的炎癥機(jī)制參與了糖尿病腎病的病理生理。Toll樣受體（TLRs）可在足細(xì)胞中表達(dá)，通過調(diào)控下游核因子κB(NF-κB)等信號(hào)分子的表達(dá)，激活炎癥反應(yīng)。已知TLRs信號(hào)通路的兩條途徑的關(guān)鍵因子分別為:髓樣分化因子介導(dǎo)的88(MyD88)接頭蛋白，Toll樣受體(TIR)適配器誘導(dǎo)干擾素β結(jié)構(gòu)域的（TRIF）銜接蛋白。目前關(guān)于TLRs/NF-κB信號(hào)通路在

5、糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中已有基礎(chǔ)研究，但具體涉及到兩個(gè)關(guān)鍵因子在糖尿病腎病中的具體表現(xiàn)少有描述。
　　金雀異黃素(GEN)是從大豆中提純的大豆異黃酮的主要組分。目前的基礎(chǔ)研究表明， GEN能緩解糖尿病小鼠腎臟氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化程度，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，但其作用機(jī)制并不明確。
　　本研究我們應(yīng)用生理濃度的GEN對(duì)高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞自噬的影響作用進(jìn)行了觀察，同時(shí)也分析了GEN對(duì)TLRs/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路和其中的相關(guān)炎癥因子

6、的干預(yù)機(jī)制，旨在探討GEN在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的干預(yù)作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)性理論研究。
　　方法:
　　1 GEN對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞自噬的影響
　　條件性永生化小鼠足細(xì)胞在33℃，γ-IFN存在的條件下培養(yǎng)傳代后，于37℃，無γ-IFN的條件下培養(yǎng)10-14天，使細(xì)胞分化成熟。免疫熒光化學(xué)檢測(cè)synaptopodin觀察足細(xì)胞成熟情況。未分化成熟的足細(xì)胞不表達(dá)synaptopodin，合格的細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)。①首先探

7、究高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的最佳時(shí)間。不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用高糖培養(yǎng)成熟小鼠足細(xì)胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h，應(yīng)用western blot檢測(cè)微管相關(guān)蛋白3(microtubuleAssociated Protein Light Chain3，LC3Ⅱ)確定高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的最佳時(shí)間。②在GEN(20μM)和時(shí)間(6h)條件下，分別設(shè)置正常糖組（5.5mM，Normal glucose，NG）、甘露醇對(duì)照組(5.5 mM gl

8、ucose+24.5 mMmannitol,MC)、高糖組(30mM，High glucose，HG)、高糖+GEN組(30mMHG+0.05％DMSO+20μM genistein，G)、高糖+自噬抑制劑（氯喹）組(30mM HG+1μM chloroquine，CQ)和高糖+氯喹+GEN組(30 mM HG+1μMCQ+0.05％DMSO+20μM GEN，CG)，應(yīng)用電鏡觀察自噬小體。③設(shè)置對(duì)照如上，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)，直觀分析LC

9、3和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，p-mTOR)的表達(dá)。④應(yīng)用western blot檢測(cè)LC3Ⅱ、p-mTOR的蛋白表達(dá)，應(yīng)用western blot和real-time PCR方法檢測(cè) nephrin的蛋白和基因水平，評(píng)估GEN對(duì)高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的影響。
　　2 GEN對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞TLRs/NF-κB通路的干預(yù)作用
　?、偈紫忍骄扛咛黔h(huán)境足細(xì)胞NF-κB p65

10、表達(dá)的最佳時(shí)間。不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用高糖培養(yǎng)成熟小鼠足細(xì)胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h，應(yīng)用western blot檢測(cè)NF-κB p65確定高糖環(huán)境足細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)的最佳時(shí)間。②在GEN(20μM)和時(shí)間(48h)條件下，分別設(shè)置正常糖組(5.5 mM，Normal glucose，NG)、甘露醇對(duì)照組(5.5 mM glucose+24.5mM mannitol，MC)、高糖組（30 mM，High glu

11、cose，HG）和高糖+GEN組（30 mM HG+0.05％DMSO+20μM GEN，G），應(yīng)用免疫熒光化學(xué)，直觀分析核因子κ B(nuclear factor kappa B，NF-κB p65)的表達(dá)。③設(shè)置組如上，應(yīng)用westem blot，檢測(cè)MyD88、TRIF和NF-κB p65的蛋白表達(dá)，應(yīng)用ELISA檢測(cè)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)。④應(yīng)用w

12、estem blot和real-time PCR方法檢測(cè)nephrin的蛋白和基因水平，評(píng)估GEN對(duì)高糖環(huán)境足細(xì)胞內(nèi)TLRs/NF-κB通路中的關(guān)鍵因子的干預(yù)作用，以及對(duì)足細(xì)胞的影響。
　　3 GEN對(duì)高糖環(huán)境下MyD88/TRIF基因敲減足細(xì)胞自噬的影響
　?、賰?yōu)化轉(zhuǎn)染條件，找出化學(xué)合成的siRNA沉默MyD88/TRIF基因表達(dá)的最佳劑量。②將分化成熟的小鼠足細(xì)胞分為高糖組(HG)、高糖+對(duì)照siRNA組(HG+con.

13、siRNA，HC)、高糖+MyD88-siRNA組(HG+MyD88-siRNA,M)、高糖+MyD88-siRNA+GEN組(HG+ MyD88-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN，MG)組、高糖+TRIF-siRNA組（HG+TRIF-siRNA,T）、高糖+TRIF-siRNA+GEN組（HG+ TRIF-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN,TG）、高糖+MyD88-siRNA+TRIF-siRNA組(

14、HG+ MyD88-siRNA+ TRIF-siRNA,MT)和高糖+MyD88-siRNA+TRIF-siRNA+GEN組(HG+ MyD88-siRNA+ TRIF-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN，MTG)。經(jīng)培養(yǎng)6h，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)，直觀分析LC3和p-mTOR表達(dá)。③設(shè)置對(duì)照如上，應(yīng)用western blot檢測(cè)LC3Ⅱ和p-mTOR的蛋白表達(dá)，應(yīng)用western blot和real-time PCR方法檢測(cè)

15、nephrin的蛋白和基因水平，評(píng)估基因敲減MyD88/TRIF后GEN對(duì)高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的影響。
　　4 GEN對(duì)高糖環(huán)境下MyD88/TRIF基因敲減足細(xì)胞TLRs/NF-κB通路的干預(yù)作用
　　將分化成熟的小鼠足細(xì)胞分為高糖組(HG)、高糖+對(duì)照siRNA組(HG+con.siRNA，HC)、高糖+MyD88-siRNA組(HG+MyD88-siRNA，M)、高糖+ MyD88-siRNA+GEN組(HG+MyD88

16、-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN,MG)組、高糖+TRIF-siRNA組(HG+ TRIF-siRNA，T)、高糖+TRIF-siRNA+GEN組(HG+TRIF-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN,TG)、高糖+MyD88-siRNA+TRIF-siRNA組（HG+ MyD88-siRNA+ TRIF-siRNA，MT）和高糖+MyD88-siRNA+TRIF-siRNA組+GEN組(HG+MyD88-

17、siRNA+TRIF-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN，MTG)。①經(jīng)培養(yǎng)48h，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)，直觀分析NF-κB p65的表達(dá)。②應(yīng)用western blot，檢測(cè)MyD88、TRIF的蛋白表達(dá)，應(yīng)用ELISA檢測(cè)MCP-1。③應(yīng)用western blot和real-time PCR方法檢測(cè)nephrin的蛋白和基因水平，評(píng)估GEN對(duì)高糖環(huán)境足細(xì)胞內(nèi)TLRs/NF-κB通路中的關(guān)鍵因子的干預(yù)作用，以及對(duì)足細(xì)胞的影響

18、。
　　結(jié)果:
　　1 GEN對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞自噬的影響
　?、?3℃時(shí)的條件永生化小鼠足細(xì)胞，F(xiàn)-actin免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示，細(xì)胞形狀呈梭形或三角形，突起較少。Synaptopodin免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示，細(xì)胞胞漿中幾乎不表達(dá)。37℃經(jīng)培養(yǎng)10-14天后的足細(xì)胞，F(xiàn)-actin免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示，細(xì)胞胞漿向四周展開，突起增多。Synaptopodin免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示，細(xì)胞胞漿中表達(dá)明顯增強(qiáng)。②高糖環(huán)境足細(xì)

19、胞自噬的時(shí)效關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在高糖培養(yǎng)足細(xì)胞6h，LC3Ⅱ表達(dá)顯著(P＜0.01)。③電鏡觀察結(jié)果:在NG組和HG組均存在自噬小體，HG組中自噬小體較NG組偏多。④免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示:LC3在HG組、G組、CQ組和CG組表達(dá)均比較明顯。p-mTOR在HG組、G組表達(dá)偏弱，CQ組表達(dá)上調(diào)。⑤western blot結(jié)果顯示:LC3Ⅱ在各組均有表達(dá)，LC3Ⅱ在HG組、G組、CQ組和CG組表達(dá)更為明顯(P＜0.01)。p-mTOR在HG組

20、、G組表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，在CQ組表達(dá)水平偏高(P＜0.01)。⑥nephrin的western blot和Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:nephrin在HG組表達(dá)下降(P＜0.01)，CQ組較CG組表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)。
　　2 GEN對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞TLRs/NF-κB通路的干預(yù)作用
　?、俑咛黔h(huán)境足細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)的時(shí)效關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在高糖培養(yǎng)足細(xì)胞48h，NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移

21、表達(dá)顯著(P＜0.05)。②免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示:NG和G組NF-κB p65主要在細(xì)胞胞漿中表達(dá)，HG組NF-κB p65主要在細(xì)胞胞核中表達(dá)。③western blot結(jié)果顯示:MyD88、TRIF在HG組較NG組表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，NF-κB p65的核蛋白表達(dá)在HG組較NG組顯著(P＜0.01)。④Nephrin的western blot和real-timePCR結(jié)果顯示:NG組和G組中表達(dá)顯著高于HG組。⑤ELISA檢測(cè)

22、結(jié)果顯示:MCP-1在HG組較NG組和G組表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。
　　3 GEN對(duì)高糖環(huán)境下MyD88/TRIF基因敲減足細(xì)胞自噬的影響
　?、費(fèi)yD88-siRNA和TRIF-siRNA驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果:MyD88-siRNA和TRIF-siRNA能夠顯著敲減高糖環(huán)境足細(xì)胞MyD88/TRIF蛋白和mRNA的表達(dá)。證實(shí)在6孔板中以70 pmol/孔轉(zhuǎn)染足細(xì)胞敲減效果最好。②免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示，LC3在MT組較其他組在胞漿

23、表達(dá)較弱，MTG組較MT組表達(dá)上調(diào)。p-mTOR結(jié)果與其相反。③應(yīng)用western blot檢測(cè)LC3Ⅱ、p-mTOR和nephrin的蛋白表達(dá)結(jié)果:與HG組相比，LC3Ⅱ在T組無明顯變化(P＞0.05)，在M組、MT組表達(dá)下降(P＜0.05);p-mTOR在M組、T組和MT組表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。與M組相比，LC3Ⅱ和nephrin在MG組表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);p-mTOR在MG組表達(dá)明顯下降(P＜0.01)。與T組相

24、比，LC3Ⅱ和nephrin在TG組表達(dá)明顯上調(diào);p-mTOR在TG組表達(dá)下降(P＜0.05)。與MT組相比，LC3Ⅱ和nephrin在MG組表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);p-mTOR在MG組表達(dá)明顯下降(P＜0.01)。④應(yīng)用real-time PCR方法檢測(cè)nephrin的基因水平，與HG組相比，nephrin在M組和T組無明顯差異(P＞0.05)，M組水平偏高(P＜0.05)，MG組、TG組和MTG組表達(dá)明顯偏高(P＜0.01)。

25、
　　4 GEN對(duì)高糖環(huán)境下MyD88/TRIF基因敲減足細(xì)胞TLRs/NF-κB通路的干預(yù)作用
　?、倜庖邿晒饣瘜W(xué)結(jié)果:與HG和HC組相比， M組、T組和MT組中NF-κB p65在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯減弱，以MT組表達(dá)最弱。加用GEN組中NF-κB p65在細(xì)胞漿表達(dá)相對(duì)明顯。②ELISA檢測(cè)MCP-1結(jié)果:與HG和HC組相比，M組、T組和MT組表達(dá)下調(diào)，GEN治療組下調(diào)更為明顯(P＜0.01)。③應(yīng)用western blo

26、t檢測(cè)NF-κB p65和nephrin結(jié)果示:與HG組相比，nucleus NF-κB p65在M組、T組和MT組表達(dá)下降(P＜0.01);nephrin在在M組、T組和MT組表達(dá)升高。與M組相比，nucleus NF-κB p65在MG組表達(dá)明顯下降(P＜0.01);nephrin在MG組表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。與T組相比，nucleus NF-κB p65在TG組表達(dá)明顯下降(P＜0.01);nephrin在MG組表達(dá)明顯升

27、高(P＜0.01)。與MT組相比，nucleus NF-κB p65在MTG組中無明顯變化(P＞0.05);nephrin在MTG組表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。④應(yīng)用real-time PCR方法檢測(cè)nephrin結(jié)果:與HG組和HC組相比，敲減基因MyD88/TRIF和應(yīng)用GEN都可使nephrin表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。⑤ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:與HG組相比，MCP-1在其他組均明顯下調(diào)。(P＜0.01)。
　　結(jié)論:

28、r>　　1在高糖刺激早期，GEN可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)揮對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　2在高糖刺激晚期，GEN具有足細(xì)胞抗炎保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制TLRs/NF-κB信號(hào)通路減輕足細(xì)胞炎癥損傷所致。
　　3在高糖刺激早期，GEN可減輕TLRs/NF-κB信號(hào)通路阻斷后自噬的下降程度。
　　4 GEN干預(yù)TLRs/NF-κB信號(hào)通路從早期抑制MyD88開始，后期也對(duì)TRIF有抑制作用。而且在高糖刺激晚期，除了干預(yù)T