補(bǔ)青顆粒對高糖誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的影響及對細(xì)胞自噬的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討補(bǔ)青顆粒對高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期的影響及對細(xì)胞自噬相關(guān)機(jī)制的影響，為補(bǔ)青顆粒用于臨床治療糖尿病性白內(nèi)障（diabetic cataract，DC）提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用永生化人晶狀體上皮細(xì)胞（SRA01/04）進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。分別以0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol

2、/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L、65mmol/L、75mmol/L、100mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)24h、48h、72h，CCK-8法評價不同濃度不同時間點(diǎn)細(xì)胞增殖活力，篩選出最適細(xì)胞增殖濃度，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，劃痕實(shí)驗(yàn)評價細(xì)胞遷移能力。
　?。?）應(yīng)用中藥血清藥理學(xué)方法制備含藥血清。將大鼠隨機(jī)分為空白對照組（給予蒸餾水10mL?kg-1）、陽性對照藥杞菊地黃

3、丸（QJ）組及補(bǔ)青顆粒高中低濃度組（10,5,1g?kg-1），每組各15只，每日灌胃給藥2次，連續(xù)3d后取大鼠血清。選取永生系人晶狀體上皮細(xì)胞（SRA01/04）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用最適葡萄糖濃度模擬高糖環(huán)境誘導(dǎo)，共分6組：10％空白血清組、高糖+10%空白血清組、高糖+10%QJ含藥血清組、高糖+10%BQ含藥血清組（10,5,1g?kg-1）。CCK-8法檢測不同血清干預(yù)高糖誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞24h增殖活性的影響，采用流式細(xì)胞技

4、術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測不同血清對高糖誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞24h細(xì)胞周期的影響。
　?。?）以空白對照血清、補(bǔ)青顆粒高濃度含藥血清、補(bǔ)青顆粒中濃度含藥血清、補(bǔ)青顆粒低濃度含藥血清干預(yù)最適造模葡萄糖濃度誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞，通過定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測SRA01/04細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)

5、基因Atg7、LC3a及Beclin1mRNA的影響，免疫熒光觀察Atg7、LC3及Beclin1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）CCK-8法測得當(dāng)葡萄糖濃度為30mmol/L培養(yǎng)時間為48h內(nèi)，SRA01/04細(xì)胞OD值達(dá)到最優(yōu)勢水平；流式細(xì)胞術(shù)顯示高糖條件下可使SRA01/04細(xì)胞G0/G1期比例減少，S期比例增加(P<0.01)；高糖組與正常組相比劃痕區(qū)內(nèi)移行的細(xì)胞數(shù)明顯增多。
　　（2）CCK-8法測得補(bǔ)青顆粒

6、含藥血清中濃度組明顯抑制 SRA01/04細(xì)胞增殖活性(P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)顯示補(bǔ)青顆粒含藥血清中濃度組使SRA01/04細(xì)胞G0/G1期比例增加，S期比例減少(P<0.01)。
　?。?）qRT-PCR檢測結(jié)果顯示補(bǔ)青顆粒不同濃度含藥血清干預(yù)高糖誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞中均檢測到自噬相關(guān)基因Atg7、LC3a及Beclin1mRNA的表達(dá)(P<0.05)，Atg7在補(bǔ)青血清高濃度組中表達(dá)最顯著(P<0.01)，LC3a和

7、Beclin1在補(bǔ)青血清高濃度組中表達(dá)最顯著(P<0.01)；免疫熒光觀察到不同濃度含藥血清組中Atg7、LC3a及Beclin1均有表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　（1）確定30mmol/L葡萄糖濃度為最佳造模濃度。高糖條件下可促成SRA01/04細(xì)胞G1/S期發(fā)生，阻滯了S/G2期的轉(zhuǎn)化；誘導(dǎo)遷移的發(fā)生。
　　（2）補(bǔ)青顆粒抑制高糖誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞增殖活力；抑制SRA01/04細(xì)胞周期G1/S期發(fā)生。