補青顆粒對高糖誘導晶狀體上皮細胞的影響及對細胞自噬的機制研究.pdf

1、目的：
　　探討補青顆粒對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞增殖活性、細胞周期的影響及對細胞自噬相關機制的影響，為補青顆粒用于臨床治療糖尿病性白內(nèi)障（diabetic cataract，DC）提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用永生化人晶狀體上皮細胞（SRA01/04）進行常規(guī)培養(yǎng)。分別以0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol

2、/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L、65mmol/L、75mmol/L、100mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)24h、48h、72h，CCK-8法評價不同濃度不同時間點細胞增殖活力，篩選出最適細胞增殖濃度，流式細胞術檢測細胞周期，劃痕實驗評價細胞遷移能力。
　　（2）應用中藥血清藥理學方法制備含藥血清。將大鼠隨機分為空白對照組（給予蒸餾水10mL?kg-1）、陽性對照藥杞菊地黃

3、丸（QJ）組及補青顆粒高中低濃度組（10,5,1g?kg-1），每組各15只，每日灌胃給藥2次，連續(xù)3d后取大鼠血清。選取永生系人晶狀體上皮細胞（SRA01/04）進行實驗，利用最適葡萄糖濃度模擬高糖環(huán)境誘導，共分6組：10％空白血清組、高糖+10%空白血清組、高糖+10%QJ含藥血清組、高糖+10%BQ含藥血清組（10,5,1g?kg-1）。CCK-8法檢測不同血清干預高糖誘導下SRA01/04細胞24h增殖活性的影響，采用流式細胞技

4、術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測不同血清對高糖誘導下SRA01/04細胞24h細胞周期的影響。
　?。?）以空白對照血清、補青顆粒高濃度含藥血清、補青顆粒中濃度含藥血清、補青顆粒低濃度含藥血清干預最適造模葡萄糖濃度誘導下SRA01/04細胞，通過定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測SRA01/04細胞內(nèi)自噬相關

5、基因Atg7、LC3a及Beclin1mRNA的影響，免疫熒光觀察Atg7、LC3及Beclin1的表達。
　　結(jié)果：
　?。?）CCK-8法測得當葡萄糖濃度為30mmol/L培養(yǎng)時間為48h內(nèi)，SRA01/04細胞OD值達到最優(yōu)勢水平；流式細胞術顯示高糖條件下可使SRA01/04細胞G0/G1期比例減少，S期比例增加(P<0.01)；高糖組與正常組相比劃痕區(qū)內(nèi)移行的細胞數(shù)明顯增多。
　?。?）CCK-8法測得補青顆粒

6、含藥血清中濃度組明顯抑制 SRA01/04細胞增殖活性(P<0.01)；流式細胞術顯示補青顆粒含藥血清中濃度組使SRA01/04細胞G0/G1期比例增加，S期比例減少(P<0.01)。
　　（3）qRT-PCR檢測結(jié)果顯示補青顆粒不同濃度含藥血清干預高糖誘導下SRA01/04細胞中均檢測到自噬相關基因Atg7、LC3a及Beclin1mRNA的表達(P<0.05)，Atg7在補青血清高濃度組中表達最顯著(P<0.01)，LC3a和

7、Beclin1在補青血清高濃度組中表達最顯著(P<0.01)；免疫熒光觀察到不同濃度含藥血清組中Atg7、LC3a及Beclin1均有表達。
　　結(jié)論：
　?。?）確定30mmol/L葡萄糖濃度為最佳造模濃度。高糖條件下可促成SRA01/04細胞G1/S期發(fā)生，阻滯了S/G2期的轉(zhuǎn)化；誘導遷移的發(fā)生。
　?。?）補青顆粒抑制高糖誘導下SRA01/04細胞增殖活力；抑制SRA01/04細胞周期G1/S期發(fā)生。