自噬參與胰島素抵抗介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷.pdf

1、目的:在全世界范圍內(nèi)，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)已經(jīng)成為引起終末期腎臟病的一個首要原因。糖尿病腎病是糖尿病的一個嚴(yán)重并發(fā)癥，大約超過40％的2型糖尿病患者會出現(xiàn)這一并發(fā)癥。以往的研究表明，胰島素抵抗是糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病原因和病程進(jìn)展中的一個關(guān)鍵性因素。在糖尿病腎病領(lǐng)域，腎臟足細(xì)胞是腎小球當(dāng)中的胰島素信號反應(yīng)細(xì)胞，失去胰島素敏感性的腎臟足細(xì)胞即使在正常的血糖條件下也會出現(xiàn)蛋白尿的表現(xiàn)，這說明足細(xì)胞中的

2、胰島素信號對于正常腎小球的功能是必不可少的。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種分解代謝過程，它通過聚集和降解功能障礙的細(xì)胞器來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬障礙與很多人類疾病密切相關(guān)，越來越多的證據(jù)表明調(diào)節(jié)自噬將會成為治療糖尿病的一個新靶點(diǎn)。目前關(guān)于在胰島素抵抗的足細(xì)胞中自噬過程是否發(fā)生改變?nèi)耘f是一個開放性的問題，而且關(guān)于自噬是否參與胰島素抵抗介導(dǎo)的腎臟足細(xì)胞損傷也不明確。本研究旨在探討:自噬在糖尿病腎病中的作用，并且主要著眼于自噬在發(fā)生胰島素抵抗的腎臟足細(xì)

3、胞中的作用。
　　方法:
　　1.用shRNA慢病毒感染腎臟足細(xì)胞，改變胰島素受體的表達(dá)，分別使用RT-qPCR及蛋白質(zhì)免疫印記(Wesrern Blot)方法來驗(yàn)證敲除效率。
　　2.敲除胰島素受體后檢測足細(xì)胞自噬水平:
　　(1)蛋白質(zhì)免疫印記(western blot)檢測腎臟足細(xì)胞自噬水平的變化。200uM胰島素分別刺激正常組，對照組，胰島素受體敲除組，用Western Blot檢測p62，Beclin;

4、50um氯喹分別刺激或不刺激對照組，胰島素受體敲除組，用WesternBlot檢測LC3的變化。
　　(2)免疫熒光檢測腎臟足細(xì)胞自噬水平的變化。200uM胰島素分別刺激對照組，胰島素受體敲除組，用免疫熒光檢測p62，Beclin及LC3的表達(dá)。
　　(3)透射電鏡檢測腎臟足細(xì)胞自噬小體數(shù)量的變化。200uM胰島素分別刺激對照組和胰島素受體敲除組，利用電鏡檢測自噬小體的數(shù)量。
　　3.敲除胰島素受體后檢測足細(xì)胞功能蛋白

5、nephrin的變化:胰島素刺激腎臟足細(xì)胞，檢測nephrin蛋白的變化。200uM胰島素分別刺激正常組，對照組，胰島素受體敲除組，用western blot和免疫熒光檢測nephrin蛋白的變化。
　　4.應(yīng)用雷帕霉素激活自噬后檢測足細(xì)胞自噬水平和nephrin蛋白表達(dá)的變化。10uM雷帕霉素刺激胰島素受體敲除組，利用western blot檢測p62和nephrin;50uM氯喹分別刺激或不刺激雷帕霉素處理組，利用wester

6、n blot檢測LC3。
　　結(jié)果:
　　1.使用shRNA慢病毒感染腎臟足細(xì)胞可以減少胰島素受體的表達(dá)。（P＜0.05）
　　2.敲除胰島素受體后自噬水平降低。(1)免疫印記表明敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與對照組腎臟足細(xì)胞相比p62表達(dá)水平明顯升高，而LC3和Beclin1的表達(dá)水平明顯降低。(P＜0.05)(2)免疫熒光顯示敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與對照組腎臟足細(xì)胞相比p62表達(dá)水平升高，而LC3和Beclin1

7、的表達(dá)降低。(3)透射電鏡顯示敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與對照組腎臟足細(xì)胞相比自噬小體的數(shù)量明顯減少。
　　3.免疫印記和免疫熒光都表明敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與對照組腎臟足細(xì)胞相比nephrin的表達(dá)降低。
　　4.雷帕霉素刺激敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞與未加入雷帕霉素的敲除胰島素受體的腎臟足細(xì)胞相比，自噬水平和nephrin的表達(dá)明顯升高。(P＜0.05)
　　結(jié)論:我們的結(jié)果表明當(dāng)腎臟足細(xì)胞失去胰島素敏感性時(shí)自