樁蛋白在TEMT中的表達及金雀異黃素的干預.pdf

1、目的：研究樁蛋白(paxillin，Pax)在轉化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)誘導人腎小管上皮細胞發(fā)生小管上皮-肌成纖維細胞轉分化(tubularepithelialtomesenchymaltransition，TEMT)過程中表達的變化及酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)特異性抑制劑金雀異黃素(genistein，Gen)的干預結果。 方法：

2、用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)液將HKC細胞接種于24孔板或培養(yǎng)瓶中，細胞長到約60％～70％匯合時，吸棄舊培養(yǎng)基，換成無血清(freeserummedium，F(xiàn)SM)同步24小時，然后分組如下：①對照(C)組：用FSM培養(yǎng)HKCs48h；②T組：用含TGF-β1的FSM培養(yǎng)HKC細胞48h，包括量效組TA組和時相組TB組，其中TA組用含有TGF-β15、10、20ng/ml的FSM培養(yǎng)HKCs48h，分為

3、T5、T10、T203個亞組；TB組用含有TGF-β110ng/ml的FSM培養(yǎng)HKCs24h、48h、72h時檢測，分為T24、T48、T723個亞組；③T+G組：10ng/mlTGF-β1和50μmol/LGen共同培養(yǎng)HKCs48h。倒置相差顯微鏡觀察HKCs的形態(tài)變化；半定量RT-PCR分析E-cadherin、alpha-smoothmuscle(α-SMA)和PaxmRNA表達的變化；免疫組化檢測E-cadherin、α-S

4、MA和Pax的蛋白表達的變化；間接免疫熒光法檢測E-cadherin、α-SMA的蛋白表達；Westernblot分析Pax蛋白表達的變化。 結果：1、細胞形態(tài)觀察①C組：HKCs細胞呈卵石樣緊密排列生長；②TA組：24h時未觀察到明顯改變，48h時T10、T20組細胞出現(xiàn)顯著的形態(tài)改變，表現(xiàn)為細胞呈梭形，長短徑比例增加，細胞之間間隙增大，部分細胞和附近的細胞脫離接觸，失去卵石樣形態(tài)；T5組細胞部分呈現(xiàn)梭形，細胞長短徑比例增加較

5、其他兩組為??；③T+G組：細胞呈卵圓形，與C組細胞形態(tài)相似。 2、E-cadherin表達水平的檢測①C組：正常HKCs細胞大量E-cadherinmRNA的表達，蛋白表達陽性。②TA組：在不同濃度的TGF-β1刺激48h后，E-cadherinmRNA及蛋白表達較C組顯著性減少(P＜0.01)，且組間降低水平具有顯著性差異(P＜0.01)。③T+G組：E-cadherinmRNA及蛋白表達呈陽性，較T10組表達顯著升高(P＜0

6、.01)，較C組仍有顯著性差異(P＜0.01)。 3、α-SMA表達水平的檢測①C組：正常HKCs中α-SMA的mRNA及蛋白表達均為陰性。②TA組：在不同濃度TGF-β1刺激48h后，α-SMAmRNA及蛋白表達較C組顯著性增加(P＜0.01)，且組間增高水平具有顯著性差異(P＜0.01)。③T+G組：α-SMAmRNA及蛋白表達較T10組表達顯著減少(P＜0.01)，但與C組仍有顯著性差異(P＜0.01)。 4、TG

7、F-β1對HKCs表達Paxillin的影響及Gen的干預①C組：RT-PCR及Westernblot結果顯示PaxmRNA和蛋白僅有微弱的基礎表達量，而免疫組化結果為陰性；②T組(包括TA、TB組)：TGF-β1可誘導HKCs的PaxmRNA及蛋白表達量較C組顯著性增加(P＜0.01)，且組間增高具有顯著性差異(P＜0.01)；③T+G組：RT-PCR結果顯示PaxmRNA僅有微弱的基礎表達量，Westernblot結果顯示蛋白水平的

8、Pax也為基礎表達量，免疫組化結果為微量的蛋白表達，均較T10組表達顯著減少(P＜0.01)，與C組比較仍有顯著性差異(P＜0.01)。 結論：1、PTK信號轉導途徑參與TGF-β1誘導的HKCs細胞發(fā)生TEMT過程； 2、TGF-β1介導HKCs細胞發(fā)生TEMT過程中伴隨著Pax表達增加，且具有量效和時效性； 3、PTK特異性阻斷劑Gen50μmol/L可部分抑制TGF-β110ng/ml介導的HKCs細胞的T

9、EMT過程以及Pax的表達。 結語 目前有關Pax的合成和降解了解甚少，Akiyama等發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導PaxmRNA表達[29]，在細胞有絲分裂時Pax降解[4]。Pax在體內(nèi)外試驗中被選作FAC替代性標志物[19]。Pax的酪氨酸和絲/蘇氨酸殘基磷酸化后發(fā)揮不同或相同的生物功能，也許是酪氨酸蛋白激酶和絲蘇氨酸蛋白激酶兩信號轉導途徑交叉點之一，尚待進一步深入探究。 腎小管間質纖維化(tubulointer

10、stitialfibrosis，TIF)是慢性腎臟病的共同途徑，TIF動物模型及臨床研究均顯示纖維母細胞和成纖維細胞均可由腎小管上皮細胞經(jīng)EMT而來。TGF-β1己成為公認的誘導EMT的關鍵的介導因子，近來研究顯示ILK是其潛在的關鍵下游效應分子[30]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導PaxmRNA表達[29]，刺激Pax磷酸化水平增加[3]且促進細胞表型轉變[15]。另有研究表明ILK能特異性結合于Pax的LD1基序調(diào)節(jié)相互信號轉導[31