三羥基異黃酮對增生性瘢痕成纖維細胞的影響及相關信號作用機制的研究.pdf

1、增生性瘢痕(hyperplastic scar，HS)的本質是成纖維細胞的異常增殖和細胞外基質的過度沉積，其在外觀和功能上嚴重影響患者的身體健康與生活質量。盡管對瘢痕的發(fā)病機理和防治方法進行了大量的研究，但迄今尚無理想的結果，尋求特殊有效的治療手段一直是整形外科研究的重要課題。5，7，4'-三羥基異黃酮(Genistein)是來源于豆類的植物雌激素類化合物，它是一種特異性酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，T

2、PK)抑制劑，大量實驗研究及流行病學調查表明Genistein對多種異常增殖的腫瘤和組織器官纖維化疾病有顯著的抑制作用，并已開始用于臨床治療，獲得了安全可靠的效果。根據(jù)Genistein的生物學特點及藥理性質，其有可能在病理性瘢痕的防治上也發(fā)揮良好的作用。 目的： 研究Genistein對HS成纖維細胞增殖與功能的生物學影響并初步探討其作用的信號轉導機制。應用體外培養(yǎng)人HS成纖維細胞模型，觀察Genistein對細胞的增

3、殖、凋亡及部分生物學功能的影響，以及Genistein作用后細胞內受體酪氨酸蛋白激酶信號通路中多個相關信號蛋白分子活化的變化情況，明確Genistein對HS成纖維細胞的生物學作用并從信號轉導途徑初步探討其可能的作用機制，為臨床應用異黃酮類藥物防治增生性瘢痕提供理想的實驗依據(jù)。 方法： 1．分離培養(yǎng)人HS成纖維細胞，加入不同濃度的Genistein作用，觀察藥物對細胞生長的影響；MTT法檢測細胞增殖；免疫細胞化學法測定細

4、胞PCNA表達；流式細胞術檢測細胞周期；TUNEL法檢測細胞凋亡；Western Blot蛋白免疫印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達。 2．不同濃度Genistein作用后，H<'3>-脯氨酸摻入法檢測HS成纖維細胞膠原合成率以及用RT-PCR技術檢測細胞內Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達變化；Western Blot法檢測TGF-β1蛋白表達；激光共聚焦顯微鏡觀察Genistein對細胞內Ca<

5、'2+>濃度的影響變化。 3．[γ-<'32>p] ATP底物摻入法檢測Genistein作用后HS成纖維細胞TPK活性變化； Western Blot法檢測Genistein作用后受體依賴型酪氨酸蛋白激酶兩條主要信號通路Ras-MAPK以及P13K-Akt中的重要信號蛋白分子c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、p38、JNK、Akt磷酸化蛋白的表達變化，初步探討其信號轉導作用機制。 結果： 1．加入

6、Genistein共培養(yǎng)后，HS成纖維細胞生長速度減慢，生長曲線顯示細胞數(shù)量增長的趨勢隨藥物劑量增加及作用時間延長而下降；細胞逐漸失去雙極性的纖維化細胞形態(tài)特征，排列紊亂，與鄰近細胞的接觸減少。 2．MTT比色結果顯示Genistein作用后各實驗組HS成纖維細胞的OD值減少，具有劑量—效應和時間—效應關系，其中100μmol/L組的抑制作用最為顯著。 3．各實驗組HS成纖維細胞內PCNA的含量下降。 4．Gen

7、istein作用后G<,0>-G<,1>期細胞數(shù)量減少，G<,2>-M期細胞比例上升；100μmol/L組中的S期細胞數(shù)量也有增加。 5．Genistein作用后細胞凋亡率增加；Bcl-2蛋白表達下降，Bax、Caspase-3蛋白的表達上調。 6．在Genistein作用下，HS成纖維細胞的膠原合成率降低；Ⅰ型及Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達下調。 7．各實驗組細胞TGF-β1蛋白的表達減少。 8．加入Ge

8、nistein后細胞內Ca<'2+>濃度下降；加入bFGF后細胞Ca<'2+>濃度升高，預先用Genistein處理可使bFGF促Ca<'2+>增高的作用顯著減弱。 9．加入Genistein后細胞內TPK活性顯著下降，并可減弱bFGF促進細胞TPK活性增加的作用。 10．不同濃度Genistein作用HS成纖維細胞后，胞內磷酸化c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、p38、Akt蛋白的含量均有不同程度的降低，其中c-

9、Raf、ERK1/2、Akt的下降變化較明顯；磷酸化JNK蛋白含量與對照組相比無顯著性差異。在Genistein作用下，加入bFGF刺激后細胞內各信號蛋白的表達顯示同樣的變化趨勢。 結論： 1．Genistein能有效抑制HS成纖維細胞的增殖，誘導細胞凋亡，其抑制增殖和誘導凋亡的作用與影響細胞周期和調節(jié)凋亡相關蛋白的表達有關。 2．Genistein能影響HS成纖維細胞的生物學功能，包括抑制細胞膠原的合成、減少T