人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（HHSFb）壓應(yīng)力效應(yīng)及其分子機(jī)制初探.pdf

1、機(jī)械應(yīng)力作用于活體細(xì)胞，研究其受應(yīng)力作用后的各種變化，是近十年來(lái)細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)展十分迅速的研究方法。業(yè)已證明，人體細(xì)胞生長(zhǎng)在機(jī)體提供的微動(dòng)力學(xué)環(huán)境中，機(jī)械應(yīng)力不僅能引起細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化，還能調(diào)控細(xì)胞的功能狀態(tài)，影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，在某些生理和病理過(guò)程中起著重要作用。目前研究較多的集中在生理、病理?xiàng)l件以及治療過(guò)程中受到機(jī)械應(yīng)力作用的細(xì)胞，如骨細(xì)胞(研究骨延長(zhǎng)技術(shù)、加壓固定治療骨折技術(shù)、骨質(zhì)疏松癥機(jī)制等)、血管平滑肌細(xì)胞(研

2、究高血壓發(fā)病機(jī)制)、腎小球系膜細(xì)胞(研究腎小球高血壓)、椎間盤細(xì)胞(研究椎間盤突出癥)以及各類干細(xì)胞等，并取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。增生性瘢痕(HyperplasticScar，HS)是臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病。由于其發(fā)病機(jī)制不明，治療遂缺乏有效手段。HS的組織學(xué)研究證實(shí)，大量排列紊亂的成纖維細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積是構(gòu)成HS的重要基礎(chǔ)，因而對(duì)其成纖維細(xì)胞的研究是目前HS防治研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。 有關(guān)HS的治療，目前臨床上均采用綜合治

3、療，其中壓迫療法對(duì)早期HS的治療有效已在臨床上達(dá)成共識(shí)，但就其治療所提供壓應(yīng)力的大小、治療時(shí)機(jī)、持續(xù)時(shí)間以及相關(guān)的分子機(jī)制尚不十分明確。既往研究提示，壓應(yīng)力對(duì)HS的血供能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致HS組織缺血(或淤血)、缺氧，從而抑制HS的生長(zhǎng)。然而對(duì)壓應(yīng)力條件下增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HSFb)本身生物學(xué)特性的改變上尚關(guān)注甚少。為此，深入認(rèn)識(shí)壓應(yīng)力對(duì)HSFb形態(tài)、增殖、凋亡的影響，以及相關(guān)分子機(jī)制，無(wú)疑對(duì)臨床上更加合理的運(yùn)用壓迫療法治療HS提供重要

4、的理論基礎(chǔ)。 本研究擬以人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HumanHyperplasticScarFibroblast，HHSFb)為對(duì)象，通過(guò)自行研發(fā)的簡(jiǎn)易氣控加壓細(xì)胞培養(yǎng)儀(國(guó)家發(fā)明專利受理號(hào)：20061006717178.3)，予細(xì)胞施加不同大小，持續(xù)不同時(shí)間的壓應(yīng)力，采用多學(xué)科的技術(shù)和方法，觀察HHSFb生長(zhǎng)特性(形態(tài)、增殖、凋亡)的變化，并初步探討其量效關(guān)系及相關(guān)分子機(jī)制。 方法： 1)應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法獲?。篐

5、HSFb。以簡(jiǎn)易氣控加壓細(xì)胞培養(yǎng)儀予細(xì)胞施以5、10、15、25、50、100、150mmHg的持續(xù)壓應(yīng)力(每組n=6)4天，不施壓設(shè)為對(duì)照組(n=6)。分別以四甲基偶氮唑(MTT)法測(cè)定細(xì)胞A值并計(jì)算其生長(zhǎng)抑制率、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)周期及Annexin-V-PI標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。 2)將HHSFb隨機(jī)分為對(duì)照組(未施壓)、持續(xù)施壓組(25mmHg，6～8天)和施壓(25mmHg，3～4天)后去除壓應(yīng)力組。分別以MTT

6、法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)周期、免疫組化觀察增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)及Annexin-V-PI標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。 3)將HHSFb隨機(jī)分為對(duì)照組(未施壓)、持續(xù)施壓組(25mmHg，12h)，提取蛋白應(yīng)用免疫印跡法(Westernblot)測(cè)定HHSFb信號(hào)傳導(dǎo)分子p38MAPK磷酸化和Caspase-3活化情況。 結(jié)果： 1)5mmHg、10mmHg壓應(yīng)力組細(xì)胞A值(0.228±

7、0.004，0.226±0.003)、DNA合成前期(G1期)細(xì)胞百分比(71.80±0.44％，72.32±0.40％)與對(duì)照組細(xì)胞A值(0.230±0.005)、G1期細(xì)胞百分比(71.46±0.49％)相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；但15、25、50、100、150mmHg壓應(yīng)力組細(xì)胞A值(0.213±0.005、0.180±0.005、0.172±0.007、0.165±0.004、0.164±0.004)，G1期細(xì)胞百分

8、比為(74.56±1.01％，82.82±2.76％、86.77±2.06％、88.23±1.27％、89.11±1.74％)與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；其中10、15、25、50壓應(yīng)力組組間比較差異顯著(P＜0.01)，細(xì)胞增殖抑制率、G1期細(xì)胞百分比與壓應(yīng)力大小呈正相關(guān)；50、100、150mmHg壓應(yīng)力組的上述結(jié)果組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，細(xì)胞抑制率、G1期細(xì)胞百分比隨壓應(yīng)力增加增長(zhǎng)不明顯。5mmHg、

9、10mmHg壓應(yīng)力組細(xì)胞早期凋亡率(4.22±0.49％，5.12±0.74％)與對(duì)照組(4.00±0.36％)相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；但15、25、50、100、150mmHg壓應(yīng)力組細(xì)胞早期凋亡率(8.58±0.79％、19.28±1.40％、25.60±1.21％、35.80±2.39％、36.18±2.3％)與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；其中10、15、25、50、100壓應(yīng)力組組間比較差異顯著(P＜0

10、.01)，細(xì)胞凋亡率與壓應(yīng)力大小呈正相關(guān)并隨壓力增加細(xì)胞凋亡率顯著增強(qiáng)；100、150mmHg壓應(yīng)力組的上述結(jié)果組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，細(xì)胞早期凋亡率隨壓應(yīng)力增加增長(zhǎng)不明顯。 2)25mmHg持續(xù)壓應(yīng)力對(duì)HHSFb的生長(zhǎng)抑制率隨加壓時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大；與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較，PCNA表達(dá)降低，處于增殖期(S+G2+M)細(xì)胞比例減??；細(xì)胞凋亡率隨施壓時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加：而施壓后去除壓應(yīng)力繼續(xù)培養(yǎng)觀察顯示，HHSFb的抑

11、制率逐漸回降，PCNA表達(dá)增加和增殖期(s+G2+M)細(xì)胞比例“反彈”增大，細(xì)胞的凋亡率也逐漸下降。 3)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞持續(xù)施壓12h后，p38MAPK的磷酸化和caspase-3活化明顯增強(qiáng)。 結(jié)論： 壓應(yīng)力(大于15mmHg)對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞具有直接抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的復(fù)合效應(yīng)，其中p38MAPK和Caspase-3是增生性瘢痕成纖維細(xì)胞壓應(yīng)力效應(yīng)的重要信號(hào)分子。結(jié)合臨床上壓迫療法具體運(yùn)用的綜