BC047440的原核表達、多克隆抗體制備及其在蛋白質(zhì)水平表達的初步研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年上升的趨勢。雖然目前對其發(fā)病機制的了解較前有了明顯進步，但還存在許多需要研究的地方。我們在前期的研究中已發(fā)現(xiàn)了1條在肝癌中高表達但其功能未知的基因(登錄號BC047440)，并發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織中的表達高于癌旁組織，且該基因的功能與肝癌生長增殖有關(guān)。為了進一步研究：BC047440在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，我們擬克隆、原核表達并制備BC047440多克隆抗體，并通過免疫組化及Westernblo

2、t等方法檢測肝癌中的蛋白表達，并分析其與肝癌臨床病理特征、術(shù)后生存期的關(guān)系，以進一步探討B(tài)C047440基因在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。 目的：構(gòu)建BC047440原核表達載體，誘導(dǎo)表達BC047440融合蛋白，并經(jīng)親和層析法純化，將其作為抗原免疫兔，制備兔抗人BC047440多克隆抗體，純化抗體后，在蛋白水平檢測該基因在肝癌中的表達情況并進行臨床病理學(xué)分析，為進一步揭示BC047440基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用

3、，對揭示肝癌發(fā)生的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。 方法： 1、復(fù)蘇、培養(yǎng)人HepG2細胞，提取其總RNA，通過RT-PCR獲得人BC047440編碼區(qū)基因片斷，構(gòu)建含目的基因的T載體克隆及原核細胞表達載體亞克隆，并經(jīng)酶切、測序證實。IPTG誘導(dǎo)表達。BC047440融合蛋白，Westernblot證實其抗原性。將重組基因工程菌擴大誘導(dǎo)表達，親和層析法純化誘導(dǎo)的蛋白。 2、將純化的蛋白與弗氏佐劑乳化，將其作為抗原免疫

4、兔，獲得兔抗人血清，經(jīng)飽和硫酸銨純化，獲得初步純化的兔抗人BC047440多克隆抗體，通過間接ELISA檢測多克隆抗體效價，用雙向瓊脂免疫擴散試驗檢測其純度，westernblot及免疫組化方法初步檢測其活性。 3、收集手術(shù)切除肝癌標本，應(yīng)用免疫組化及westernblot方法檢測了BC047440在肝癌、癌旁肝組織及正常肝組織中的BC047440蛋白表達，并分析其與肝癌臨床病理特征、術(shù)后生存率等的關(guān)系，以探討B(tài)C047440

5、基因在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。 結(jié)果： 1、獲得人BC047440編碼區(qū)基因片段，并經(jīng)測序證實。 2、獲得人BC047440基因重組基因工程菌的克隆，并表達具有抗原性的BC047440融合蛋白。 3、獲得純化的BC047440融合蛋白，并用其免疫兔，得到兔抗人BC047440多克隆抗體。 4、以重組蛋白為抗原，用間接ELISA檢測BC047440抗血清的效價達到1:2560

6、00。 5、雙向瓊脂免疫擴散試驗顯示BC047440多克隆抗體與免疫原之間形成單一沉淀線，表明所制備的多抗具有良好的純度。 6、免疫印跡分析BC047440抗血清在分子量約23kd處與相應(yīng)的原核表達蛋白呈現(xiàn)特異性結(jié)合條帶，表明所制備的多克隆抗體具有較好的免疫學(xué)活性。 7、免疫組化染色顯示BC047440表達部位主要位于胞漿，在肝癌及癌旁組織均有表達，但肝癌組織中的表達明顯強于癌旁肝組織及正常肝組織。

7、 8、58例肝癌標本的免疫組化檢測中，BC047440表達陽性數(shù)為47(81.0％)。58例癌旁肝組織標本中，BC047440表達陽性數(shù)為12(20.7％)。作為陰性對照的正常肝組織中，BC047440表達陽性數(shù)為0。 9、BC0474410免疫組化檢測為陽性的肝癌患者(47例)和陰性的肝癌患者(11例)在病理學(xué)分級、門靜脈侵犯、腫瘤包膜侵犯上的差異有顯著意義(P＜0.05)。而在AFP定性、腫瘤大小、HbsAg定性上的差異

8、無顯著意義(P＞0.05)。 10、肝癌BC047440免疫組化檢測為陽性的患者3年生存率明顯比BC047440陰性的患者低(p＜0.05)，BC047440表達陽性和門靜脈侵犯共同存在時患者的3年生存率比在兩者都陰性的患者明顯降低(p＜0.05)，BC047440表達陽性和腫瘤包膜侵犯共同存在時患者的3年生存率比在兩者都陰性的患者明顯降低(p＜0.05)。 11、Westernblot檢測BC047440在肝癌組織

9、和癌旁肝組織中表達量的差異有顯著意義(P＜0.05)，在肝癌組織和正常肝組織中表達量的差異有顯著意義(P＜0.05)，而在癌旁肝組織和正常肝組織中表達的差異量無顯著意義(P＞0.05)。 12、Westernblot檢測BC047440高表達的患者(32例)和低表達的患者(26例)在侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理學(xué)特征(病理學(xué)分級、腫瘤包膜侵犯、門靜脈侵犯)上的差異均具有顯著意義(P＜0.05)。 結(jié)論：經(jīng)重組基因工程菌誘導(dǎo)

10、表達的BC047440融合蛋白具有免疫原性，將其作為免疫原制備的兔抗人BC047440多克隆抗體能與BC047440融合蛋白發(fā)生反應(yīng)，檢測BC047440多克隆抗體效價、純度、活性均達到預(yù)期要求。檢測BC047440在蛋白質(zhì)水平表達發(fā)現(xiàn)，BC047440在肝癌中的表達例數(shù)(量)明顯高于癌旁肝組織和正常肝組織，BC047440的高表達與肝細胞癌的侵襲性、轉(zhuǎn)移性的增強，患者預(yù)后差有著密切的關(guān)系。BC047440可能在肝細胞癌初期的發(fā)生發(fā)展以