白芍總苷在大鼠體內(nèi)的排泄及其對(duì)CYP3A蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)是自白芍根中提取的有效部位，以芍藥苷(Paeoniflorin，Pae)和芍藥內(nèi)酯苷(Albiflorin，Alb)的含量最高。課題組前期比較了TGP在正常和急性CCl4肝損傷大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)其在正常和病理狀態(tài)下的參數(shù)明顯不同，并對(duì)TGP的胃腸吸收、血漿蛋白結(jié)合率、組織分布等特點(diǎn)進(jìn)行了研究。為進(jìn)一步研究TGP的藥代動(dòng)力學(xué)，明確其體內(nèi)排泄特點(diǎn)，研究

2、TGP對(duì)肝藥酶CYP3A蛋白表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)以HPLC法為手段，采用固相萃取方法同時(shí)測(cè)定Pae和Alb在大鼠尿液、糞便和膽汁中的含量，明確TGP的主要排泄途徑，同時(shí)以正常大鼠和急性CCl4肝損傷大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用Western Blot法觀察TGP對(duì)大鼠CYP3A蛋白表達(dá)的影響，探討TGP保肝作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1白芍總苷在大鼠體內(nèi)的排泄研究
　　1.1色譜條件
　　采用phenomenex C

3、18色譜柱(4.6×250 mm，5μm)，流動(dòng)相均為乙腈-0.1％冰乙酸，尿液樣品流動(dòng)相比例為16:84，糞便及膽汁樣品比例均為13:87；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量均為10μL。
　　1.2樣品預(yù)處理
　　1.2.1尿樣預(yù)處理
　　精密量取尿樣0.4mL，加入蒸餾水0.2 mL及內(nèi)標(biāo)龍膽苦苷溶液20μL，渦旋混勻后通過(guò)已活化的固相萃取小柱，先用10％的甲醇2 mL淋洗雜質(zhì)，繼用甲

4、醇1 mL洗脫，洗脫液定容至1 mL，離心(12000 r/min)，取上清液10μL進(jìn)樣分析。
　　1.2.2糞便預(yù)處理
　　將糞便樣品于-40℃保存24 h以上，冷凍干燥，稱定重量，研碎，取糞便凍干粉0.01 g，加入1 mL蒸餾水，渦旋混勻5 min，離心(12000 r/min)10 min，取上清液0.2 mL，加入蒸餾水0.2 mL及內(nèi)標(biāo)龍膽苦苷溶液20μL，渦旋混勻，其余處理同“尿樣預(yù)處理”。
　　1.2

5、.3膽汁預(yù)處理
　　取膽汁樣品0.2 mL，其余操作同“尿樣預(yù)處理”。
　　1.3排泄研究
　　1.3.1 TGP在大鼠尿液和糞便中的排泄
　　Wistar大鼠5只，置代謝籠中，灌胃給予TGP水溶液(1.41 g/kg)，分別收集各時(shí)間段尿液及糞便，HPLC法測(cè)定樣品中Pae和Alb濃度，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自含量。
　　1.3.2 TGP在大鼠膽汁中的排泄
　　大鼠灌胃給予TGP水溶液(1.41

6、g/kg)，腹腔注射25％烏拉坦麻醉，分離膽總管并行膽管插管引流術(shù)，收集各時(shí)間段的膽汁，HPLC法測(cè)定樣品中Pae和Alb濃度，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自含量。
　　2白芍總苷對(duì)正常大鼠CYP3A蛋白表達(dá)的影響
　　25只大鼠按體重隨機(jī)分為5組(正常對(duì)照組，TGP低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組)。正常對(duì)照組給予純化水，TGP低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予TGP0.47、1.41、2.82 g/kg，連續(xù)14天；陽(yáng)性對(duì)照組于第1

7、1天腹腔注射地塞米松75 mg/kg，連續(xù)4天。第15天將各組大鼠斷頭處死，取肝，差速離心法制備肝微粒體，Western Blot法檢測(cè)CYP3A蛋白表達(dá)。
　　3白芍總苷對(duì)急性CCl4肝損傷大鼠CYP3A蛋白表達(dá)的影響
　　30只大鼠按體重隨機(jī)分為6組(正常對(duì)照組，模型組，TGP低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組)。正常對(duì)照組與模型組給予純化水，TGP低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予TGP0.47、1.41、2.82 g/kg，

8、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠給予聯(lián)苯雙酯0.2 g/kg，連續(xù)14天。于末次給藥后2 h，除正常對(duì)照組注射等量生理鹽水，其余5組均皮下注射50％CCl4玉米油復(fù)制急性CCl4肝損傷模型，16h后將大鼠斷頭處死，取血分離血清測(cè)定ALT、AST；取肝，稱總重，計(jì)算肝臟系數(shù)；肝左葉的相同部位用10％甲醛溶液固定，常規(guī)石臘包埋，HE染色，光鏡下觀察組織損傷程度；部分肝組織差速離心法制備肝微粒體，Western Blot法檢測(cè)CYP3A蛋白表達(dá)。
　　結(jié)

9、果：
　　1白芍總苷在大鼠體內(nèi)的排泄研究
　　1.1方法學(xué)考察
　　大鼠尿液、糞便和膽汁中Pae、Alb及內(nèi)標(biāo)峰在本條件下專屬性良好，陰性無(wú)干擾，日內(nèi)和日間精密度RSD均在10％以內(nèi)，準(zhǔn)確度均在90％～110％之間，兩者及內(nèi)標(biāo)的提取回收率均在90％以上，樣品預(yù)處理前后室溫放置和凍融循環(huán)后仍保持穩(wěn)定。
　　1.2 TGP在大鼠尿液、糞便和膽汁中的排泄
　　大鼠灌胃給予1.41 g/kg TGP后，48 h尿液

10、和糞便及36 h膽汁中芍藥苷的累積排泄量分別為(610.0±53.9)、(60630.4±4546.3)、(5640.3±504.3)μg，占給藥量的(0.583±0.042)％、(59.11±6.87)％和(4.88±0.43)％；芍藥內(nèi)酯苷的累積排泄量分別為(158.0±21.1)、(27315.1±2383.4)、(2462.1±211.2)μg，占給藥量的(0.424±0.056)％、(74.70±9.17)％和(5.98±0.

11、48)％。
　　2白芍總苷對(duì)正常大鼠CYP3A蛋白表達(dá)的影響
　　與正常對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組給予地塞米松能夠顯著誘導(dǎo)CYP3A的蛋白表達(dá)(P＜0.01)，比正常對(duì)照組提高140％；TGP低、中劑量組較正常對(duì)照組有增高趨勢(shì)，分別較正常對(duì)照組提高9％、19％，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；TGP高劑量組顯著誘導(dǎo)CYP3A的蛋白表達(dá)，比正常對(duì)照組提高44％(P＜0.01)。
　　3白芍總苷對(duì)急性CCl4肝損傷大鼠CYP3

12、A蛋白表達(dá)的影響
　　3.1 TGP對(duì)急性CCl4肝損傷大鼠肝臟系數(shù)的影響
　　與正常對(duì)照組相比較，大鼠皮下注射CCl4后，模型組大鼠肝臟系數(shù)明顯上升，顯著高于正常對(duì)照組大鼠(P＜0.01)；與模型組比較，經(jīng)TGP與DDB預(yù)處理能顯著降低肝損傷所致肝臟系數(shù)上升(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.2 TGP對(duì)CCl4所致大鼠急性肝損傷肝功能的影響
　　與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠ALT、AST值明顯升高(P＜

13、0.01)；與模型組比較，預(yù)先給予TGP或DDB，能夠顯著降低ALT、AST水平(P＜0.05或P＜0.01)，且TGP高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組療效明顯優(yōu)于TGP低、中劑量組。
　　3.3 TGP對(duì)CCl4所致大鼠急性肝損傷肝組織病理學(xué)觀察
　　正常對(duì)照組大鼠肉眼觀察肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤(rùn)，邊緣整齊，質(zhì)地柔軟；鏡下可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊且胞核形態(tài)正常，肝細(xì)胞索清晰可辨，未見(jiàn)腫脹、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。模型組大

14、鼠肉眼見(jiàn)肝臟體積腫大，灰暗呈土黃色，邊緣變鈍，質(zhì)脆；鏡下見(jiàn)肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞境界不清并出現(xiàn)氣泡樣變，細(xì)胞索解離，肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)彌散性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；TGP各給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組均不同程度地減輕上述病理改變。
　　3.4 TGP對(duì)急性CCl4肝損傷大鼠CYP3A蛋白表達(dá)水平的影響
　　與正常對(duì)照組相比，模型組CYP3A的蛋白表達(dá)明顯減少，較正常對(duì)照組下降31％(P＜0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組給予DDB顯著誘導(dǎo)

15、CYP3A的蛋白表達(dá)，比模型組提高59％(P＜0.01)；TGP低、中、高劑量組亦顯著誘導(dǎo)CYP3A的蛋白表達(dá)，分別較模型組提高16％(P＜0.05)、30％(P＜0.01)、52％(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1大鼠灌胃給予1.41g/kgTGP，尿液、糞便及膽汁中芍藥苷的累積排泄量分別占給藥量的(0.583±0.042)％、(59.11±6.87)％和(4.88±0.43)％；芍藥內(nèi)酯苷的累積排泄量分別占給藥量的(

16、0.424±0.056)％、(74.70±9.17)％和(5.98±0.48)％。表明TGP在體內(nèi)主要經(jīng)膽汁排泄。
　　2正常大鼠灌胃給予低、中、高(0.47、1.41、2.82 g/kg)劑量TGP連續(xù)14天，24 h后制備肝微粒體，Western Blot法檢測(cè)CYP3A的蛋白表達(dá)。TGP低、中劑量組較正常對(duì)照組有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TGP高劑量組明顯誘導(dǎo)CYP3A的蛋白表達(dá)，較正常對(duì)照組提高44％，提示TGP的保肝機(jī)制