高脂飲食及CYP3A基因多態(tài)性對硝苯地平在健康志愿者體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響.pdf

1、目的：硝苯地平是一種重要的二氫吡啶類鈣離子拮抗劑,主要用于治療心血管疾病,因其臨床療效確切且價(jià)格低廉,應(yīng)用十分廣泛。但經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn),硝苯地平的處置具有較大的個(gè)體差異,目前認(rèn)為這種差異可能是由遺傳因素造成的。硝苯地平是CYP3A4和CYP3A5的經(jīng)典底物,可被代謝轉(zhuǎn)化為無藥理活性的氧化硝苯地平,而CYP3A4*1G和CYP3A5*3在中國漢族人群中存在較高的頻率,且已證實(shí)其突變對他汀類等許多藥物的代謝和療效均有影響。因此,我們推測導(dǎo)致硝

2、苯地平代謝出現(xiàn)個(gè)體差異的遺傳因素可能是CYP3A4和CYP3A5的基因多態(tài)性。另外,有研究表明高脂飲食能夠影響阿雷地平的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué),同為脂溶性較強(qiáng)的藥物,硝苯地平的代謝是否也受高脂飲食的影響?本實(shí)驗(yàn)擬研究CYP3A4*1G和CYP3A5*3基因多態(tài)性及高脂飲食對硝苯地平藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響,試圖尋找硝苯地平處置個(gè)體差異的遺傳標(biāo)志物和食物因素,從而為臨床上使用硝苯地平提供個(gè)體化用藥依據(jù)。
　　 方法：⑴共90名健康志愿者參與該

3、項(xiàng)研究?？崭菇M:45名健康受試者,男32例,女13例,平均年齡23.13±1.89y,平均體重65.17±7.96 kg,平均身高170.03±7.25 cm;高脂餐組:45名健康受試者,男23例,女22例,平均年齡23.22±2.49y,平均體重59.19±8.47 kg,平均身高165.92±8.53 cm。經(jīng)血尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖檢查,各項(xiàng)檢查指標(biāo)均正常。本研究得到鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),各受試者均自愿參與試驗(yàn)并于

4、試驗(yàn)前由本人簽署知情同意書。⑵受試者在試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用任何藥物?？崭菇M在服藥前禁食10 h,服藥后4h進(jìn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐;高脂餐組在服藥前30 min進(jìn)高脂餐,并在25 min內(nèi)進(jìn)餐完畢,服藥后4h進(jìn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。90例志愿者均于早晨8點(diǎn)口服硝苯地平片90 mg,用240ml溫開水送服,分別于服藥前、服藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、24、36和48 h取靜脈血5 ml,置EDTA抗凝

5、試管中,1 h內(nèi)離心和分離血漿,-80℃保存待測。⑶將空腹組受試者按CYP3A4*1G和CYP3A5*3進(jìn)行基因分型,分別比較CYP3A4和CYP3A5不同基因型之間的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),擬尋找導(dǎo)致硝苯地平體內(nèi)代謝個(gè)體差異的遺傳因素;比較空腹組與高脂餐組受試者之間的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),以探討高脂飲食對硝苯地平體內(nèi)代謝的影響。⑷采集空腹組受試者外周靜脈血2 ml,用“酚-氯仿”法提取基因組DNA;采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增CYP3A4和CYP3A

6、5目的片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析。根據(jù)CYP3A4基因型將受試者分為3組:CYP3A4*1/*1(野生純合子)29例,CYP3A4*1/*1G(突變雜合子)12例,CYP3A4*1G/*1G(突變純合子)4例:根據(jù)CYP3A5基因型將受試者也分為3組:CYP3A5*1/*1(野生純合子)3例,CYP3A5*1/*3(突變雜合子)18例,CYP3A5*3/*3(突變純合子)24例。⑸色譜柱為Phenomenex

7、 Hydro-RP80A(2.0×150 mm,4μm)柱,流動(dòng)相(含0.05％蟻酸和2 mM醋酸銨)為乙腈:水=60:40,流速0.4 ml/min,柱溫為25℃;離子源為ESI源,源電壓1.5 KV,加熱模塊溫度200℃,干燥氣流速0.5 L/min,負(fù)離子模式檢測,掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM),用于定量的離子分別為硝苯地平m/z:345.1/122.1,內(nèi)標(biāo)(硝苯地平-d6)m/z:351.1/122.1。樣品處理:吸取50μ

8、l稀釋液(50%甲醇),分別加入到50μl含有質(zhì)控樣品(QC)、檢測樣品、雙空白及空白樣品血漿樣品中;向標(biāo)準(zhǔn)液、空白、質(zhì)控樣品及檢測樣品中各加入20μl內(nèi)標(biāo)溶液(硝苯地平-d6,20 ng/ml),雙空白中加入20μl稀釋液;向各管中分別加入300μl乙腈,1000 rpm渦旋10 min;6000 g離心10 min,取50μl上清液加入250μl超純水,1000 rpm渦旋10min;取10μl進(jìn)行LC-MS/MS分析。⑹用3p97

9、軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)均以-x±s來表示。CYP3A4和CYP3A5三種基因型之間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的比較采用單因素方差分析,空腹組與高脂餐組之間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①硝苯地平藥時(shí)數(shù)據(jù)按權(quán)重系數(shù)為1/C2擬合度最好。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.101 x+0.00155,回歸系數(shù)r2=0.99911,線性范圍0.5-250ng/ml,最低檢測限為0.5

10、ng/ml;平均回收率為97.9%,日內(nèi)、日間變異范圍＜15%,樣品穩(wěn)定性良好。方法準(zhǔn)確度、靈敏度、穩(wěn)定性均符合生物樣品分析要求。②CYP3A4*1/*1、CYP3A4*1/*1G和CYP3A4*1G/*1G的曲線下面積AUC0-48h分別為1878.58±597.60 ng·h/ml、1769.76±515.78 ng·h/ml和1510.51±331.73 ng·h/ml,三者之間的AUC0-48h無顯著性差異(P=0.535);曲

11、線下面積AUC0-∞在CYP3A4*1/*1、CYP3A4*1/*1G和CYP3A4*1G/*IG中分別為2071.79±733.21ng·h/ml、1807.26±501.54 ng·h/ml和1545.89±290.50 ngh/ml,AUC0-∞在三個(gè)基因型之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.287);血漿吸收半衰期(T1/2Ka)和消除半衰期(T1/2Ke)在CYP3A4*1/*1、CYP3A4*1/*1G和CYP3A4*1G/*1G中

12、分別為2.09±1.62 h、1.85±1.59 h、2.29±1.75 h和11.04±6.34 h、7.82±1.80h、8.55±3.98 h,T1/2Ka和T1/2Ke在三組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.875;P=0.212);峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(Tmax)在CYP3A4*1/*1、CYP3A4*1/*1G和CYP3A4*1G/*1G三種基因型中分別為148.95±54.57 ng/ml、137.10±43.74 ng

13、/ml、121.05±89.22ng/ml和3.80±1.75 h、4.25±1.29 h、6.50±6.61h,突變純合子與野生純合子、突變雜合子相比,Tmax具有延長趨勢,Cmax有降低趨勢,但均未達(dá)到顯著性差異(P=0.630;P=0.145)。③CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3的AUC0-48h分別為1065.82±143.87 ng·h/ml、1705.88±487.28 ng·h/ml和

14、1994.44±565.98 ng·h/ml,CYP3A5*3/*3與CYP3A5*1/*1相比顯著增大,三者之間的AUC0-48h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048);CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3的AUC0-∞分別為1186.08±96.51 ng·h/ml、1766.72±468.25 ng·h/ml和2387.96±1309.14 ng·h/ml,CYP3A5*3/*3基因型的AUC0-∞較C

15、YP3A5*1/*1顯著增大,三種基因型之間的差異具有顯著性(P=0.043);T1/2Ka和T1/2Ke在CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3三個(gè)基因型中分別為0.91±0.80 h、2.28±1.39 h、1.87±1.75 h和11.93±1.04 h、8.60±3.52 h、11.41±7.34 h,T1/2Ka和T1/2Ke在三者之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.487;P=0.450);Cmax和

16、Tmax在CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3三種基因型中分別為72.93±17.47 ng/ml、132.47±47.25 ng/ml、159.32±53.37 ng/ml和1.75±0.35 h、4.63±2.81 h、3.96±1.73 h,突變純合子與野生純合子、突變雜合子相比,Cmax有增大趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.054),Tmax在三者之間的差異也未達(dá)到顯著性(P=0.220)。④空腹

17、組和高脂餐組的AUC0-48h分別為1818.33±557.48 ng·h/ml和2567.88±1054.25 ng·h/ml,高脂餐組比空腹組顯著增大(p=0.000);AUC0-∞分別為1952.99±659.12 ng·h/ml和2638.95±1143.97 ng·h/ml,高脂餐組也顯著大于空腹組(P=0.002);T1/3Ka和T1/2Ke在空腹組和高脂餐組中分別為2.03±1.58 h、4.92±4.01 h和9.89±

18、5.36 h、11.53±6.72 h,兩組之間的半衰期無顯著性差異(P=0.106;P=0.704):Cmax和Tmax在兩組中分別為143.30±53.39 ng/ml、291.10Q90.44 ng/ml和4.14±2.26 h、5.28±2.99 h,高脂餐組的峰濃度顯著大于空腹組(P=0.000),達(dá)峰時(shí)間在高脂餐組中有延長趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.06)。
　　 結(jié)論：⑴口服硝苯地平后不同CYP3A5基因型曲線下