結核分枝桿菌潛伏感染新型候選標志物的篩選及目的蛋白的克隆、表達與純化.pdf

1、目的：篩選結核分枝桿菌潛伏感染新型候選標志物，建立蛋白質體外克隆、表達及純化的方法。
　　方法：收集2011年至2015年就診于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院的涂陽患者、其他肺部疾病患者、潛伏感染以及正常人血清，將前期工作中雙向凝膠電泳（2-DE）western blot和質譜分析篩選出的特異性蛋白與結核分枝桿菌蛋白芯片技術初步篩選出的與結核分枝桿菌潛伏感染相關的特異性蛋白相結合，制作成蛋白小芯片，通過人血清進行臨床驗證，進一步確定候選標志物

2、。通過設計所篩選的候選標志物 Rv0494基因引物， PCR擴增Rv0494基因，構建pET28a-Rv0494重組質粒，轉染至BL21(DE3)細胞，IPTG誘導體外表達Rv0494蛋白，利用鎳樹脂對體外表達的Rv0494蛋白進行純化。
　　結果：初步篩選出100個特異性蛋白，制作成小芯片，進一步臨床驗證明確8個與潛伏感染相關的候選生物標志物組合，分別是Rv0494、Rv3301c、Rv1860、Rv1821、Rv0280、Rv

3、0351、Rv2031c和Rv1441c，診斷特異度為90.9％，靈敏度為83.1%，其中Rv0494(針對IgG)和Rv1441c(針對IgM)表現(xiàn)出較好的特異性。相關結果申請了國家發(fā)明專利1項（申請?zhí)?01610089096.2）。體外表達Rv0494蛋白，鎳樹脂純化獲得單一表達的Rv0494蛋白。
　　結論：通過雙向凝膠電泳（2-DE）western blot、質譜分析及結核分枝桿菌蛋白芯片技術成功篩選并初步臨床驗證明確8個