結(jié)核分枝桿菌新的分子標(biāo)志物篩選及clpP2基因在結(jié)核病快速診斷中的初步應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病仍是一個(gè)致死性傳染病，全球有三分之一的人口潛在性感染結(jié)核，更有三分之一的結(jié)核病人未得到診斷和治療。目前對肺結(jié)核病人的診斷仍然依賴于細(xì)菌學(xué)方法，比如痰涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，而這些方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床病人的需要。為控制結(jié)核病，WHO全球行動(dòng)計(jì)劃的主要焦點(diǎn)是發(fā)展簡單和節(jié)省費(fèi)用的診斷方法，以提高病例的檢測。但是目前結(jié)核病診斷仍缺乏精確迅速的POINT-OF-CARE（POC）診斷測試。因此迫切需要尋找特異性好、敏感性高的分子靶標(biāo)以及發(fā)展

2、相應(yīng)的費(fèi)用低廉的快速床旁診斷測試，這有利于結(jié)核病能夠得到早期的診斷、治療和疫情控制。本研究采用生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合，鑒定和評價(jià)適合用于結(jié)核病診斷的分子靶標(biāo)，建立高靈敏度和特異性且對儀器依賴程度低的結(jié)核分枝桿菌快速檢測方法。
　　方法：
　　1.通過對結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）全基因組序列分析，檢測Mtb必需基因序列單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide po

3、lymorphisms, SNPs）和插入/缺失（insertion/deletions, Indels)。篩選SNPs、indels發(fā)生率盡可能低的必需基因，作為結(jié)核病的潛在分子診斷靶標(biāo)。本研究從這些候選基因中選擇clpP2基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.采用生物信息學(xué)方法詳細(xì)評價(jià)Mtb clpP2基因的診斷潛能。計(jì)算分枝桿菌屬clpP2基因核苷酸組成、密碼子偏性、變異性，對clpP2基因DNA多態(tài)性進(jìn)行了分析，推測clpP2基因發(fā)生H

4、GT事件可能性。構(gòu)建clpP2基因分子進(jìn)化樹，評價(jià)clpP2基因?qū)tb與非結(jié)核分枝桿菌的區(qū)分能力。通過同源對比分析，從信息學(xué)角度評價(jià)clpP2基因靶標(biāo)的種屬特異性。
　　3.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，是一種新的核酸擴(kuò)增方法，已廣泛用于床旁（Point-of-care）測試。本研究以結(jié)核分枝桿菌clpP2基因?yàn)榘袠?biāo)，建立可視LAMP檢查方法，在本研

5、究中將其命名為可視clpP2-LAMP。本實(shí)驗(yàn)對clpP2-LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，評價(jià)clpP2-LAMP敏感性和特異性及在臨床標(biāo)本檢測中的應(yīng)用價(jià)值。
　　4.從信息學(xué)角度推測Mtb ClpP2蛋白用于結(jié)核病的診斷應(yīng)該具有一定的特異性，因此本研究原核表達(dá)Mtb ClpP2蛋白，制備anti- ClpP2兔多克隆抗體，對ClpP2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的亞定位、不同應(yīng)激條件下細(xì)菌體內(nèi)的表達(dá)水平、免疫特性進(jìn)行了分析，進(jìn)一步測定結(jié)核病人血清中

6、ClpP2蛋白及抗體水平，分析其在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1.從H37Rv基因組中共下載615個(gè)必需基因，利用GMTV（Genome-wide Mycobacterium tuberculosis variation)數(shù)據(jù)庫對這些必需基因序列進(jìn)行SNPs、indels進(jìn)行分析，將SNPs和indels發(fā)生率均<1％的必需基因作為潛在的診斷靶標(biāo)，共篩選到45個(gè)必需基因。clpP2基因具有很低的單核苷酸多態(tài)性和種屬特

7、異性，是本研究進(jìn)一步研究的靶標(biāo)分子。
　　2.對分枝桿菌屬clpP2基因進(jìn)行了較為詳盡的序列分析：（1）對其核苷酸組成、密碼子偏性、變異性及DNA多態(tài)性進(jìn)行了分析，表明clpP2基因高度保守，不易發(fā)生HGT事件；（2）分析Mtb的clpP2基因同源序列，在呼吸道非Mtb病原體基因組中沒有發(fā)現(xiàn)同源核酸序列，而編碼氨基酸序列進(jìn)行對比，同源程度大約為50%左右，該結(jié)果表明clpP2基因用作分子診斷靶標(biāo)具有很好的特異性；（3）構(gòu)建了clp

8、P2基因進(jìn)化樹，clpP2進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與16s rRNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，但是進(jìn)化距離明顯比16s rRNA的進(jìn)化距離大，能夠?qū)tb與非結(jié)核分枝桿菌屬區(qū)分。
　　3.基于 Mtb clpP2基因，成功建立了可視的clpP2-LAMP法。clpP2-LAMP法的敏感性高于普通PCR100倍，用87株分枝桿菌和18株非分枝桿菌驗(yàn)證clpP2-LAMP法的準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確性為100%。將clpP2-LAMP法直接用于臨床標(biāo)本的檢測，共檢

9、測152例，與“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)法結(jié)果相比符合度為98%。
　　4.成功克隆和重組Mtb ClpP2蛋白酶在大腸桿菌中表達(dá)。結(jié)果表明，Mtb ClpP2蛋白酶有較強(qiáng)的免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生多克隆抗體。肺結(jié)核患者血清ClpP2抗原和抗體水平均增加。ClpP2抗原對結(jié)核病診斷ROC曲線下的面積（AUC)為0.911，敏感性為72.2％，特異性為91.3％。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)過生物信息學(xué)分析，Mtb clpP2基因高度保守，