鴨瘟強毒TK基因的原核表達及在感染鴨組織亞細胞定位研究.pdf

1、根據(jù)本實驗室發(fā)現(xiàn)的鴨瘟病毒(DPV)TK基因(GenBank登錄號DQ640611)設(shè)計并合成了特異性引物，對DPVTK基因進行PCR擴增、序列測定及生物信息學分析，并開展了TK基因原核表達及其免疫原性檢測，間接免疫過氧化物酶組織化學染色法(IISM)和間接免疫熒光法(IFA)檢測DPVTK基因表達產(chǎn)物方法的建立及其在人工感染鴨體內(nèi)表達定位的系列研究，獲如下結(jié)果： 1.DPVTK基因分子特性該基因含1077bp，編碼358aa。

2、TK蛋白含有兩個功能結(jié)構(gòu)域：ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(-DGXXGXGK-)和核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(-DRH-)。系統(tǒng)進化樹表明DPVTK基因與MDV、ILTV、HVT等禽類皰疹病毒的進化關(guān)系最近，與其他皰疹病毒關(guān)系則較遠。 2.DPVTK基因原核表達及其多克隆抗體制備對擴增的TK基因進行pMD18-T載體克隆，通過對pMD18-T-TK及pET-32a(+)進行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切、連接，將TK基因定向插入pET-32a(+)，經(jīng)

3、BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表明，成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a-TK，并轉(zhuǎn)化入表達宿主菌BL21(DE3)，用IPTG進行誘導表達，表達產(chǎn)物以融合表達的包涵體形式存在，大小為58Ku左右。對表達條件進行優(yōu)化，確定最佳表達條件為IPTG0.6mmol/L，誘導4h。 利用重組表達蛋白所帶的6×His標簽用鎳柱親和層析方法對其進行純化，獲得較高純度的重組蛋白。過柱純化蛋白對家兔進行免疫，制備兔高免血清，Western-Bl

4、otting檢測顯示，與重組表達蛋白特異性結(jié)合；ELISA效價高達1:512000。 3.間接免疫組化和間接免疫熒光法檢測DPVTK基因表達產(chǎn)物方法的建立及其在人工感染鴨體內(nèi)表達定位對制備兔抗DPVTK高免血清，采用High-Q陰離子柱層析純化得到兔抗DPVTKIgG，建立間接免疫過氧化物酶組織化學染色法(IISM)和間接免疫熒光法(IFA)檢測石蠟切片中DPV的方法；利用建立的IISM和IFA對28日齡鴨人工感染DPV死亡鴨不