去泛素化酶CYLD通過下調(diào)Nrf2調(diào)節(jié)心臟重構(gòu)和功能障礙.pdf

1、背景：
　　自從泛素(Ub)在1970年代初發(fā)現(xiàn)，泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)已成為細胞生物學(xué)的幾乎所有方面的一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)點[1-3]。由5部分構(gòu)成泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS):泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)、蛋白酶體和去泛素化酶(DUBs)。E1s、E2s和E3s依次催化完成蛋白的泛素化過程。去泛素化酶(DUBs)介導(dǎo)泛素化蛋白的去泛素化過程。人體中有八個不同類型的E1s、E2s和數(shù)以百計的E3s。人類

2、基因組能編碼出一百種有活性的去泛素化酶。
　　在維持心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)心臟功能障礙中，泛素、E1s、E2s、E3s和蛋白酶體發(fā)揮著重要作用;但是，去泛素化酶在維持心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)心臟功能障礙中的作用尚未廣泛研究。目前有研究表明，在心衰的心臟中，某些去泛素化酶表達水平上調(diào)，如A20、腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白(TNFAIP3)、泛素特異性蛋白酶5(USP5)、USP20、泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)[4-6]。唯一一個已經(jīng)在心

3、臟中研究過的去泛素化酶是A20。研究表明，A20是心臟重構(gòu)和功能失調(diào)的一個負調(diào)性節(jié)因子，其作用是通過抑制NF-κB的活化，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路[5-7]來實現(xiàn)。在心臟的病理生理過程中，其他的去泛素化酶的影響現(xiàn)在仍然未知。
　　CYLD是去泛素化酶中的一種。最初在家族性遺傳疾病家族性圓柱瘤中發(fā)現(xiàn)，這種疾病表現(xiàn)為易患皮膚附屬器腫瘤?；颊叩腃YLD基因突變[8]。后續(xù)研究表明，CYLD調(diào)

4、節(jié)多個生理過程，包括細胞周期和精子發(fā)生和破骨細胞發(fā)生的免疫反應(yīng)，以及在癌癥、肺纖維化和炎癥性腸病的發(fā)病機理中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9-11]。在分子水平上，CYLD的信號功能決定于細胞類型和刺激類型[12]。然而，人們普遍認為CYLD主要負調(diào)節(jié)IκB激酶(IKK)復(fù)合物從而抑制NF-κB介導(dǎo)的信號通路，但也能夠抑制其他信號通路，如MAPK和TGF-β信號通路。鑒于上述CYLD和A20在信號通路調(diào)節(jié)上的相似性，可以假設(shè)CYLD類似于A20是抑制

5、心臟病理重構(gòu)和功能障礙的發(fā)生，對心臟起保護作用。
　　因此，在原假設(shè)的基礎(chǔ)上，我們研究的目的是探討CYLD對心臟的保護作用。但是，我們的后續(xù)研究表明，并沒有像最初假設(shè)的一樣，CYLD和A20一樣對心臟起保護作。CYLD卻扮演了一個引起心臟功能失調(diào)的角色。在分子水平上，心臟中CYLD對NF-κB通路調(diào)節(jié)作用很小，而是通過抑制ERK和p38介導(dǎo)的c-jun、c-myc、C-fos的表達，從而下調(diào)Nrf2的表達，使氧化應(yīng)激增強，導(dǎo)致心臟

6、功能失調(diào)。Nrf2是抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[13-16]。因此，CYLD是一個新的在心臟中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的因子，它通過下調(diào)Nrf2，進而抑制了Nrf2介導(dǎo)的依賴于NF-κB信號通路的抗氧化作用。上述一系列作用導(dǎo)致了心臟適應(yīng)不良重構(gòu)和功能障礙。
　　目的：
　　1.我們探討了去泛素化酶(DUBs) CYLD在維持心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)心臟功能障礙中的作用。
　　2.CYLD最有可能通過在心臟壓力超負荷情況下，提高心肌

7、氧化應(yīng)激反應(yīng)來實現(xiàn)。
　　3.在分子水平，CYLD阻斷ERK和p38/AP-1和c-Myc通路，從而抑制Nrf2介導(dǎo)的抗氧化能力，進而增強心臟中的氧化應(yīng)激。從而發(fā)現(xiàn)了一類可能治療心臟疾病的新的治療靶點。
　　方法：
　　1.人體心臟標(biāo)本。
　　2.構(gòu)建及鑒定CYLD敲除小鼠。
　　3.建立主動脈弓縮窄(TAC)疾病模型。
　　4.超聲檢測主動脈弓縮窄(TAC)引起的后負荷增加心臟疾病小鼠的心功能情況。

8、
　　5.檢測主動脈弓縮窄(TAC)疾病小鼠的病理學(xué)特征。
　　6.組織免疫學(xué)檢測心肌細胞肥大、纖維化、凋亡、CYLD表達。
　　7.實時定量PCR(Q-PCR)檢測基因表達。
　　8.深度測序(SEQ)分析。
　　9.Western Blot檢測蛋白表達。
　　10.新生大鼠原代心肌細胞培養(yǎng)。
　　11.制備CYLD敲除腺病毒以及CYLD、Nrf2小干擾RNA。
　　12.細胞內(nèi)活性氧(

9、ROS)測量。
　　13.[3H]亮氨酸攝取。
　　14.脂肪超載。
　　15.LDH細胞活性測定。
　　16.應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.在心衰的人和嚙齒動物的心臟中CYLD表達上調(diào)。
　　2.CYLD-/-小鼠能改善病理性的壓力超負荷后引起的心肌氧化應(yīng)激，心臟的不良重塑，心力衰竭。
　　3.CYLD-/-小鼠病理性的壓力超負荷

10、的心臟中，c-fos、c-jun、c-myc和Nrf2表達上調(diào)。
　　4.沉默CYLD上調(diào)Nrf2的表達，是通過激活心肌細胞中ERK、p38/AP1和c-Myc途徑。
　　5.沉默CYLD抑制氧化應(yīng)激，是通過上調(diào)心肌細胞中的Nrf2。
　　結(jié)論：
　　1.以上結(jié)果表明，CYLD導(dǎo)致適應(yīng)不良的心臟重構(gòu)和功能障礙。通過，增加心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)來實現(xiàn)。
　　2.在分子水平上，CYLD阻斷ERK和p38/AP-1和c